番茄中SARK同功能基因的篩選與克隆.pdf

1、隨著基因重組以及遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)體系的發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷完善并得到日益廣泛的應(yīng)用，在培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗逆植物新品種方面存在巨大潛力。葉片衰老是葉片發(fā)育的最后一個(gè)階段，研究葉片衰老不僅有助于了解其發(fā)育過(guò)程，也可通過(guò)調(diào)控衰老進(jìn)程來(lái)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量或延長(zhǎng)農(nóng)產(chǎn)品的貯藏期，促進(jìn)其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用。
　　本課題以模式番茄Micro-Tom(SolanumlycopersicumL.)為實(shí)驗(yàn)材料，利用番茄轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了GVG:GUS轉(zhuǎn)基

2、因番茄植株，對(duì)T0代植株進(jìn)行分子鑒定，T1代幼苗進(jìn)行誘導(dǎo)染色，以確定目的基因的轉(zhuǎn)入及其遺傳穩(wěn)定性。利用GVG:GUS轉(zhuǎn)基因番茄通過(guò)GUS組織化學(xué)染色確定了GVG誘導(dǎo)體系(誘導(dǎo)劑是地塞米松dexamethasone， DEX)，并以此為對(duì)照。取苗齡20天左右長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，誘導(dǎo)24h時(shí)的半定量RT-PCR結(jié)果顯示GVG:AtSARK各株系DEX處理后都有AtSARK基因的表達(dá);誘導(dǎo)一周后可以觀察到與野生型及GVG:GUS對(duì)照株系相比，At

3、SARK基因的表達(dá)對(duì)GVG:AtSARK轉(zhuǎn)基因番茄造成非常嚴(yán)重的影響，植株生長(zhǎng)受到抑制，早衰致死。
　　將DEX誘導(dǎo)的GVG:AtSARK幼苗提取RNA送芯片分析，通過(guò)對(duì)芯片數(shù)據(jù)的分析，篩選出表達(dá)上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AtSARK的轉(zhuǎn)基因番茄中，LRR162基因表達(dá)上調(diào)，可能參與葉片衰老過(guò)程。為了進(jìn)一步分析該基因的功能，克隆該基因并構(gòu)建了GVG誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)的雙元表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化入Micro-Tom中，得到了GVG:LRR162抗性