阿維菌素4--OH氧化酶CYP107Z13的基因克隆、表達及功能驗證.pdf

1、阿維菌素是一種結構新穎、農畜兩用的重要生物源殺蟲劑,對阿維菌素4"-OH進行改造可以獲得藥效更高、殺蟲譜更廣的甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽(甲維鹽)。當前,甲維鹽的生產是以天然發(fā)酵產物阿維菌素為前體,通過化學方法合成,其中最關鍵的反應步驟是將阿維菌素4"-OH氧化為4"-O。由于在對阿維菌素4"-OH氧化前后必須對分子中更加活躍的5-OH進行保護和去保護,且這個保護-去保護過程操作復雜、條件要求苛刻,導致了甲維鹽合成成本較高且對環(huán)境污染嚴重。

2、尋求廉價、高效、環(huán)保的生物催化劑,實現對阿維菌素4"-OH的位點特異性氧化,將大大簡化甲維鹽的合成步驟,有利于甲維鹽的推廣應用。據報道,一些鏈霉菌具有位點特異性氧化阿維菌素生成4"-O-阿維菌素的功能。筆者針對鏈霉菌進行篩選,獲得一株能夠高效氧化阿維菌素4"-OH生成4"-O的不吸水鏈霉菌菌株ZB01(Streptomyces ahygroscopicus ZB01,CGMCC NO.2804),該菌株在72 h內對初始濃度為1 g／L

3、的阿維菌素轉化率達36％,是已報道的轉化效率最高菌株的兩倍多,具有較大的開發(fā)應用潛力。本研究以S.ahygroscopicus ZB01為出發(fā)菌株,展開了一系列的研究。結果如下:
　　 1.利用同源克隆及染色體步移的方法,從S.ahygroscopicus ZB01菌株基因組中克隆到一條cyp107z亞家族基因的同源基因,其全長1290 bp,共編碼429個氨基酸殘基,經國際P450命名委員會命名為cyp107213,是cyp1

4、07z基因亞家族的第13個新成員。
　　 2.利用多拷貝型大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒pKC1139,建立了組成型啟動子ermE*P調控下的cyp107z13鏈霉菌表達載體,采用原生質體轉化法將重組質粒轉入變鉛青鏈霉菌TK54(Streptomyces lividians TK54)中,經CO光譜分析和HPLC檢測,證實cyp107z13基因在S.lividiansTK54中成功表達,并且表達的CYP107213能利用S.livid

5、arts TK54的電子傳遞系統(tǒng)實現電子傳遞,完成位點特異性氧化阿維菌素4"-OH生成4"-O-阿維菌素的反應。
　　 3.對上述S.lividians TK54重組菌的轉化條件進行優(yōu)化,結果顯示,培養(yǎng)基種類、pH值和菌體的活力狀態(tài)對重組茵轉化阿維菌素的效率有不同程度的影響。其中pH6.0、改良ISP-2液體培養(yǎng)基以及活化細胞有利于提高重組菌轉化阿維菌素的效率。
　　 4.利用pET28a載體,構建cyp107z13的重

6、組質粒pET-z13,將pET-z13轉入Escherichia coliBL21(DE3)中,經EIJSA及CO差光譜法檢測,證實CYP107213已在E.coli BL21(DE3)中成功表達,并采用Ni-柱親和層析法純化了帶His6標簽的活性CYP107Z13重組蛋白。
　　 5.利用純化的CYP107Z13重組蛋白,與鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶構建體外重組酶催化體系,通過測定體系中NADPH的消耗,獲得了該重組蛋白以阿