朱砂葉螨中阿維菌素作用靶標相關基因克隆與表達研究.pdf

1、朱砂葉螨（Tetranychuscinnabarinus）是一種世界性的害螨，危害包括棉花和蔬菜在內的多種植物，在我國分布范圍廣。目前化學防治依然是控制朱砂葉螨的主要方法，朱砂葉螨因其世代周期短、繁殖能力強、受藥機會多、近親交配率高，抗藥性問題比其他作物害蟲更為突出。
　　 阿維菌素是具有殺蟲、殺螨和殺線蟲活性的大環(huán)內酯類化合物。作為一種廣譜、高效的農藥，它已廣泛用于各種農、林及衛(wèi)生害蟲害螨的防治。隨著使用頻率的不斷增加，已有不

2、少害蟲對其產生了抗藥性。阿維菌素的靶標抗性是近些年研究的熱點。
　　 本研究運用分子生物學技術，克隆可能與朱砂葉螨對阿維菌素產生抗藥性有關的γ-氨基丁酸受體(GABAR)和谷氨酸氯離子通道(Glucl)，比較朱砂葉螨敏感品系和抗性品系中GABAR與Glucl氨基酸差異，并對朱砂葉螨不同螨態(tài)（卵、幼螨、若螨、成螨）和不同品系（敏感品系，SS;阿維菌素抗性品系，AbR;甲氰菊酯抗性品系，FeR）中GABAR與Glucl的mRNA表達

3、量進行比較分析。從分子水品初步探討了朱砂葉螨對阿維菌素產生抗性與GABAR和Glucl的關系，為明確阿維菌素的作用靶標，以及研究和開發(fā)新型殺螨劑奠定基礎。本研究獲得的主要成果如下:
　　 (1)成功克隆了朱砂葉螨兩條Glucl基因的cDNA全長序列，分別命名為TcGlucl1和TcGlucl2，GenBank登錄號分別為JX501237和JX548319。TcGlucl1開放閱讀框長為1365bp，編碼454個氨基酸;TcGlu

4、cl2開放閱讀框長為1650bp，編碼550個氨基酸?？缒そY構域預測顯示TcGlucl1有4個跨膜結構域，TcGlucl2有5個跨膜結構域。分子進化樹分析表明，在選擇分析的18個物種中，與朱砂葉螨的兩條Glucl親緣關系最近的是二斑葉螨（Tetranychusurticae），其次是肩板硬蜱（Ixodesscapularis），親緣關系最遠的是線蟲綱的物種;從進化樹的根緣關系來看，蛛形綱中的朱砂葉螨及二斑葉螨和線蟲綱中的腫孔古柏線蟲（C

5、ooperiaoncophora）的Glucl基因在Glucl基因類群中較為原始。TcGlucl1與TcGlucl2間的序列同源性為48.56％，空間結構模擬顯示兩者的差異主要集中在結構域的個數以及環(huán)的所在位置上。
　　 (2)克隆獲得了朱砂葉螨GABAR的1條cDNA全長序列和4條片段序列，其中TcGABARA2為全長序列，TcGABARA1、TcGABARA3、TcGABARB1和TcGABARB2為片段序列。在GenBan

6、k中的登錄號依次為EU362111、KC708069、KC708070、KC708071和KC708072。NCBI序列比對結果表明這些序列均為GABAR。
　　 (3)對朱砂葉螨SS和AbR中的GABARs和Glucls進行氨基酸序列比對，結果發(fā)現，TcGABAA1、TcGABAA2、TcGABAB2、TcGlucl1與TcGlucl2在SS和AbR中并未存在氨基酸水平的差異;而與SS相比，AbR中的TcGABAA3、TcGA

7、BAB1分別出現了1個和2個位點的氨基酸突變。其中TcGABAA3的氨基酸發(fā)生了N280D突變，TcGABAB1的兩個氨基酸則分別發(fā)生了N219S和S396P突變。推測這些位點的氨基酸差異可能與阿維菌素抗性相關。
　　 (4)運用Real-TimePCR技術，檢測了朱砂葉螨卵、幼螨、若螨和成螨中GABARs與Glucls的mRNA表達量，結果為:朱砂葉螨的Glucls和GABARs在不同螨態(tài)均有一定表達，各基因在幼、若螨中的表達

8、量普遍偏高，而在卵中的表達量是最低的，在成螨中的表達量則介于卵和幼、若螨間。
　　 (5)運用Real-TimePCR技術，檢測了朱砂葉螨SS、AbR和FeR品系中GABARs與Glucls的mRNA表達量，結果為:TcGlucl1、TcGlucl2、TcGABAA1和TcGABAA2的表達量在兩種抗性品系間無顯著差異，但都顯著低于在SS品系中表達;TcGABAB1和TcGABAB2的表達量分別在三個品系間無顯著差異;TcGAB