姜黃素對(duì)朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶活性及基因表達(dá)的影響.pdf

1、朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)可危害多種作物，是最重要的世界性經(jīng)濟(jì)害螨之一。該螨具有世代周期短、繁殖能力強(qiáng)等生物學(xué)特性，這種螨的特性加上長(zhǎng)期以來化學(xué)殺螨劑的大量使用，使“3R”問題日益嚴(yán)重，因此迫切需要開發(fā)尋找高效低毒的新型螨類控制劑。植物源殺螨活性物質(zhì)，易溶于水，對(duì)非標(biāo)靶生物低毒，無殘留，還可通過非目標(biāo)生物體生物降解，因此，這些化合物成為新型螨類控制劑的重要選擇對(duì)象之一。姜黃素(curcumin)主要提取

2、于中藥植物姜黃(Curcuma longa)，研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)朱砂葉螨表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性。天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究室為驗(yàn)證姜黃素的殺螨活性，進(jìn)行了大量的生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素處理后，螨出現(xiàn)大量失水、體表皺縮等死亡癥狀，這些癥狀表現(xiàn)說明姜黃素可能作用于螨的體壁結(jié)構(gòu)。幾丁質(zhì)是螨體壁的主要組成成分，其合成和降解在螨的生長(zhǎng)發(fā)育過程中有至關(guān)重要的作用。但是目前對(duì)姜黃素的致死機(jī)制研究多集中在解毒酶系活性的變化，而其對(duì)幾丁質(zhì)的合成和降解酶系的影響尚未

3、研究報(bào)道。本研究以幾丁質(zhì)酶為切入點(diǎn)，從生理生化及分子水平兩個(gè)方面研究了姜黃素處理下朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的變化，從而推測(cè)對(duì)幾丁質(zhì)降解的影響，以期為探明姜黃素對(duì)朱砂葉螨的作用機(jī)制提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.測(cè)定了姜黃素對(duì)朱砂葉螨雌成螨的觸殺毒力，得到了各亞致死劑量利用玻片浸漬法測(cè)得姜黃素處理朱砂葉螨48h后的毒力回歸方程為y=-0.474+1.234x，LC50為2.424mg/mL，95％的置信區(qū)間為1.715～3.733mg

4、/mL。48h后的亞致死劑量即LC40、LC30、LC20、LC10分別為1.511、0.911、0.504和0.222mg/mL。測(cè)定了各亞致死劑量姜黃素處理下對(duì)朱砂葉螨發(fā)育歷期的影響。結(jié)果表明，朱砂葉螨卵期、幼螨期、若螨期和成螨期與對(duì)照相比總體上呈縮短的趨勢(shì)，并無顯著差異，但是雌成螨的平均壽命顯著縮短。
　　2.明確了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的基本酶學(xué)性質(zhì)利用改良的schales法，研究了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的基本酶學(xué)性質(zhì)，包括最適反應(yīng)溫

5、度及熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性、金屬離子對(duì)酶活性的影響和動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值。朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度約為35℃，對(duì)高溫比較敏感；最適反應(yīng)pH約為7.0，在pH值為6.0時(shí)最穩(wěn)定；金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活性存在影響，大部分的金屬離子對(duì)酶有較強(qiáng)的抑制作用，但也有少數(shù)的金屬離子對(duì)酶有激活作用；水解膠狀幾丁質(zhì)的Km值為5.15μmol/L。這些研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了螨類相關(guān)幾丁質(zhì)酶生物學(xué)特性研究，可為基于幾丁質(zhì)酶的殺螨劑篩選奠定理論基礎(chǔ)。

6、
　　在測(cè)定了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)定了螨不同發(fā)育階段酶活性的情況。分析結(jié)果表明，卵期酶比活力最低，若螨期酶比活力最高，且卵期和若螨期具有顯著性差異。這可能因?yàn)橛昨腿趄谑球懫ぐl(fā)育的階段，急需幾丁質(zhì)酶發(fā)揮作用，促進(jìn)幾丁質(zhì)的降解。用不同濃度姜黃素處理朱砂葉螨雌成螨24h后，隨著濃度的升高幾丁質(zhì)酶比活力不斷降低，在2.0和4.0mg/mL時(shí)與對(duì)照相比已存在顯著差異，特別在4.0mg/mL，對(duì)幾丁質(zhì)酶的抑制率達(dá)到

7、了約32%。由此推測(cè)，姜黃素的殺螨作用機(jī)制可能與幾丁質(zhì)酶有關(guān)。
　　3.克隆并分析了6條朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶基因(chitinase，TcCHTs)的cDNA序列參考朱砂葉螨近緣種二斑葉螨(Tetranychus urticae)的全基因組信息，利用RT-PCR技術(shù)，克隆獲得了6條TcCHTs的cDNA序列。這6條基因分別命名為TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3、TcCHT4、TcCHT5和TcCHT6，GenBank登錄

8、號(hào)分別為KT956964、KT956965、KT956966、KT956967、KT956968和KT9569692。6條幾丁質(zhì)酶基因的結(jié)構(gòu)域存在差異：其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3和 TcCHT4推導(dǎo)的氨基酸序列含有一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域，而TcCHT5和TcCHT6由跨膜域代替了信號(hào)肽。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為60.80、69.03、104.32、59.75、45.63和49.05kDa，等

9、電點(diǎn)分別為5.44、8.65、6.23、6.07、6.12和8.27。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示這6條基因與各自相對(duì)應(yīng)的二斑葉螨基因聚在同一支上。
　　4.測(cè)定了朱砂葉螨TcCHTs基因在不同發(fā)育階段及姜黃素處理后表達(dá)量的差異在完成了對(duì)6條TcCHTs克隆與分析的基礎(chǔ)上，利用RT-qPCR測(cè)定了其在朱砂葉螨不同發(fā)育階段的表達(dá)量。結(jié)果顯示，幼螨和若螨期的基因表達(dá)量顯著高于卵期和成螨期，其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3