阿維菌素抗膠質瘤作用及其相關機制研究.pdf

1、研究背景:
　　腦膠質母細胞瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，其惡性程度高、發(fā)病率高，病人預后差。化療作為治療惡性腫瘤的一個重要手段，然而藥物使用一段時間后，絕大多數(shù)的腫瘤細胞都會產生耐藥性，從而導致化療的失敗。根據(jù)美國癌癥學會統(tǒng)計，在死亡的病人當中有90％以上的人存在耐藥性，由FDA批準的治療膠質母細胞瘤化療藥物中替莫唑胺由于其全身毒副作用小，可以很好的透過血腦屏障，被廣泛用臨床一線當中。但腫瘤細胞也不可避免的對其產生了耐藥性，

2、所以篩選和研發(fā)增敏替莫唑胺殺傷作用的藥物是很有必要的。阿維菌素（avermectins，AVMs）是由阿維鏈霉菌產生的一類大環(huán)內酯類抗生素。AVMs通常是用來治療寄生蟲感染等疾病，主要是通過觸殺和胃毒作用來發(fā)揮對害蟲的毒殺效果。研究發(fā)現(xiàn)AVMs可以抑制P-糖蛋白對其底物的外排作用，從而降低腫瘤細胞的多藥耐藥性。本課題組在前期預實驗中也發(fā)現(xiàn)AVMs對膠質瘤U87細胞、膠質瘤U251細胞的增殖均有明顯抑制作用，且可以誘導細胞凋亡，但其作用機

3、制尚未明確。本文就以膠質瘤U87、U251和T98細胞為研究對象，探討AVMs抗腫瘤的作用機制，為阿維菌素抗腫瘤新藥研發(fā)及其臨床應用提供堅實的理論基礎。
　　第一部分 阿維菌素對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及其相關機制研究
　　研究目的:
　　研究阿維菌素對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及其相關機制。
　　研究方法:
　　1.分別用不同濃度的AVMs（0、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM）處理膠

4、質瘤兩種細胞系(U87和U251)不同時間（24、48、72小時），采用MTT法檢測AVMs對細胞增殖的影響;
　　2.不同濃度的AVMs（0、4μM、8μM）處理細胞72小時后，用AnnexinⅤ-FITC/PI染色膠質瘤細胞，在流式細胞儀下檢測細胞凋亡的情況;
　　3.不同濃度的AVMs（0、4μM、8μM）處理細胞72小時采用JC-1法染色各組細胞，流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位;
　　4.不同濃度的AVMs(0

5、、4μM、8μM)處理細胞72小時后，提取總RNA反轉錄并采用Real-time PCR檢測bcl-2、bax、caspase3mRNA表達水平;
　　5.不同濃度的AVMs（0、4μM、8μM）處理細胞72小時后，提取總蛋白，用Western blotting檢測bcl-2、bax、caspase3蛋白表達水平。
　　研究結果:
　　1.AVMs對膠質瘤U87和U251細胞增殖有抑制作用，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性;

6、r>　　2.AVMs可以誘導膠質瘤U87和U251細胞的凋亡，實驗組相對于對照組凋亡率均增加了(P＜0.05);
　　3.AVMs可以U87和U251細胞的線粒體跨膜膜電位，實驗組相對于對照組紅/綠熒光強度比均增加了(P＜0.05);
　　4.PCR和Western bloting結果提示:AVMs可以促進U87和U251細胞中caspase3、bax mRNA和蛋白分子的表達水平(P＜0.01)，同時降低bcl2mRNA和

7、蛋白分子的表達水平(P＜0.01)。
　　研究結論:
　　1.AVMs具有抑制膠質瘤U87和U251細胞增殖的作用;
　　2.AVMs可以促進膠質瘤U87和U251細胞的凋亡，其作用機制可能是與觸發(fā)線粒體凋亡途徑有關。
　　第二部分 阿維菌素對替莫唑胺殺傷膠質瘤細胞的影響及相關機制研究
　　研究目的:
　　研究阿維菌素對替莫唑胺殺傷膠質瘤細胞的影響及其相關機制。
　　研究方法:
　　1.分

8、別用MTT法檢測AVMs、TMZ以及AVMs+TMZ對膠質母細胞瘤三種細胞系（U87、U251和T98）增殖的影響，測出它們的IC50;
　　2.采用Chou-Talalay法評估AVMs與TMZ的聯(lián)合效應;
　　3.不同濃度的AVMs（0、4μM、8μM）處理細胞72小時后，采用RT-PCR檢測ABCB1、ABCG2以及MGMTmRNA分子表達水平;
　　4.不同濃度的AVMs(0、4μM、8μM)處理細胞72小時后

9、，采用Western blotting檢測ABC轉運蛋白(ABCB1、ABCC1、ABCG2)以及MGMT蛋白分子表達水平。
　　研究結果:
　　1.AVMs、TMZ以及AVMs+TMZ對膠質瘤細胞增殖均有抑制作用，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性;
　　2.AVMs+TMZ在IC50的時候對U87、U251以及T98細胞的CI（聯(lián)合指數(shù)）分別為:0.85、0.72、0.34;
　　3.RT-PCR和Western blo