抗人腦膠質(zhì)瘤IgY抗體的制備及其特性分析.pdf

1、目的：腦膠質(zhì)瘤是最常見并且多發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療等手段的療效均不是很理想<'[1]>。膠質(zhì)瘤細(xì)胞動力學(xué)研究表明，由于腫瘤呈浸潤性生長，有相當(dāng)一部分腫瘤處于暫時靜息狀態(tài)，即使切除了99﹪的腫瘤組織，8周后就可增殖恢復(fù)到原來的大小。隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及生物工程技術(shù)的發(fā)展，給腦膠質(zhì)瘤的治療帶來了新的希望。其中抗體介導(dǎo)的免疫診斷治療已成為腫瘤治療研究的熱點之一<'[2]>。 所謂IgY抗體就是一種從卵

2、黃中提取的具有特殊生物學(xué)功能的免疫球蛋白<'[3]>。由于雞屬于非哺乳動物，與人類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，故它對人類的病原體具有強免疫應(yīng)答。膠質(zhì)瘤IgY抗體能特異而選擇性的識別腦膠質(zhì)瘤組織，因此它可以作為一種小型而高效的導(dǎo)向載體把毒素有目的地運輸?shù)侥[瘤細(xì)胞上，當(dāng)載體識別腫瘤細(xì)胞后，立即與腫瘤細(xì)胞結(jié)合而釋放毒素，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞而不影響其它正常細(xì)胞的目的<'[4]>。此外IgY的制備成本低且產(chǎn)量高，亦無毒副作用，將成為大規(guī)模抗體制備的一種有效手

3、段。本研究旨在制備人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 IgY抗體，并對其基本特性進行分析、鑒定，從而為腦腫瘤的診治提供新的思路。 方法：1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所惠贈的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，于37℃、5﹪CO<,2>條件下常規(guī)培養(yǎng)、傳代。 2.本研究所用的實驗動物為購于遼寧省遼陽益康生物制品廠的京白雞，正常飼養(yǎng)一周后，準(zhǔn)備用于免疫。 3.收集長勢良好的U251細(xì)胞用生理鹽水配制成懸液，按照10<'9>個細(xì)

4、胞/只雞免疫產(chǎn)蛋京白雞，初次免疫時需要加入等量的福氏完全佐劑，分別于雙翅膀皮下，左右背部皮下進行點注射。免疫一周后，逐日收集其所產(chǎn)的蛋，標(biāo)記好時間，4℃保存?zhèn)溆谩?4.本研究以免疫前及免疫后第15、20、25、30、35、40、45天收集到的雞蛋為研究對象，去除蛋清，收集卵黃液經(jīng)過蒸餾水粗提，50﹪飽和硫酸銨鹽析，透析、以及聚乙二醇濃縮等步驟得到純化的 IgY 抗體<'[5]，這里我們將其命名為AG-IgY(Against gl

5、ioma IgY)。蛋白質(zhì)定量后，再通過免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法對所提抗體進行鑒定。結(jié)果：經(jīng)抗原免疫的母雞，10天左右就可從其所產(chǎn)蛋的卵黃中檢測出特異性IgY抗體，抗體量在35天左右達(dá)到高峰，每個雞蛋可收獲100～200mg抗體。其熱穩(wěn)定性、耐酸性均較好，效價可以持續(xù)2～6個月。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，AG-IgY抗體與IJ251膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈強陽性反應(yīng)，陽性部位主要位于細(xì)胞膜

6、及細(xì)胞質(zhì)。經(jīng)純化的AG-IgY通過還原性SDS-PAGE顯示兩條帶，其分子量約為70kD和20kD。ELISA結(jié)果顯示，IgY與肝癌、肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤細(xì)胞L187等其他抗原之間無交叉反應(yīng)。Westem blot檢測所得結(jié)果完全相同。 結(jié)論：1．本實驗成功制備獲取了抗人腦膠質(zhì)瘤的IgY抗體。 2．通過對其理化性質(zhì)、SDS-PAGE、Westem blot以及ELISA的研究結(jié)果表明，AG-IgY抗體是一種耐酸、耐熱、