Nampt抑制劑FK866抗星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Nicotinamide Phosphoribosyltransferase，Nampt），是哺乳動物體內(nèi)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）生物合成的限速酶，通過合成NAD廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)重要生理病理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nampt與腫瘤的關(guān)系密切，Nampt已經(jīng)成為一些腫瘤藥物治療的新靶點，體內(nèi)外研究表明其特異性抑制劑FK866（APO866）

2、具有明顯抗腫瘤活性，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及自吞噬，并已作為抗部分實體瘤的新藥進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗。星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤是最常見的腦腫瘤，惡性度高，對傳統(tǒng)抗腫瘤藥物均不敏感。研究發(fā)現(xiàn)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)Nampt，但在星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)大量誘導(dǎo)表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤的惡性程度正相關(guān)。為研究Nampt是否可以作為抗星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤的新靶點，F(xiàn)K866是否有抗星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤的作用，我們采用大鼠星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株，觀察FK866對細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡

3、及自吞噬、細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響；并初步研究FK866抗腫瘤活性與MARK通路和p53之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 （1）MTT試驗發(fā)現(xiàn)FK866時間和濃度依賴性地抑制C6細(xì)胞活性，其抑制作用能夠被Nampt的直接代謝產(chǎn)物NMN（0.01-1 mM）逆轉(zhuǎn)。FK866對C6細(xì)胞活性的抑制作用需48-72 h，作用72 h后的最大抑制率達(dá)86.3％，IC50約為10 nM（-8.07logM），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于臨床膠質(zhì)瘤治療藥物順鉑（-5

4、.83 logM）和替莫唑胺（-2.82 logM）；FK866還能夠濃度依賴性的抑制三種人星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44、U251和BT325的活性，IC50與C6細(xì)胞的IC50接近，Western blot發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞均有Nampt的表達(dá)；而原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞也有Nampt的表達(dá)，其細(xì)胞活性同樣能夠被FK866抑制，但免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在小鼠腦內(nèi)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞并無Nampt表達(dá)。
　　 （2）流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)FK866

5、100 nM可引起部分細(xì)胞凋亡，而10和100 nM均可引起細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)LC3陽性顆粒，顯示細(xì)胞發(fā)生自吞噬，但自吞噬抑制劑3MA和LY294002對FK866引起的細(xì)胞活性下降無明顯抑制作用，說明細(xì)胞活性的顯著下降與自吞噬無明顯關(guān)系。
　　 （3）MTT試驗和細(xì)胞計數(shù)均發(fā)現(xiàn)FK866作用48 h后能夠濃度依賴性的抑制C6細(xì)胞增殖，其IC50約為40nM，1 mMNMN可抑制FK866的作用；流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，40 nM F

6、K866作用48 h可使G2期細(xì)胞百分率由8.78％上升到21.25％（P<0.001），G1期細(xì)胞的百分率由61.93％下降到48.78％（P<0.001），S期的百分率無明顯變化，顯示FK866誘導(dǎo)C6細(xì)胞發(fā)生G2/M阻滯，該作用同樣能夠被1 mM NMN逆轉(zhuǎn)。
　　 （4）Western blot發(fā)現(xiàn)C6細(xì)胞在生長過程中，有明顯ERK1/2激活，而：FK86640 nM作用48 h能夠顯著抑制ERK1/2磷酸化，但對JNK

7、和p38無明顯影響；ERK1/2抑制劑U0126可濃度依賴性抑制C6細(xì)胞的活性，與FK866合用時的抑制效應(yīng)與單獨應(yīng)用時的作用相近，提示兩者對細(xì)胞活性的抑制作用是通過共同的通路。U012620μM對C6細(xì)胞的細(xì)胞周期無影響，而U012640μM可使G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，產(chǎn)生G1/S阻滯，提示FK866誘導(dǎo)的G2/M阻滯與ERK抑制無關(guān)。p53抑制劑PFT對FK866誘導(dǎo)的G2/M阻滯無影響。
　　 我們的研究顯示，F(xiàn)K8

8、66通過抑制Nampt酶活性→減少NAD的合成→抑制ERK激活→抑制細(xì)胞增殖→抑制細(xì)胞活性；另外，可誘導(dǎo)部分細(xì)胞發(fā)生自吞噬，高濃度時可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時可引起p53和ERK非依賴的細(xì)胞周期G2/M阻滯，其中FK866對腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的調(diào)控是我們首次發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明Nampt是星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤的一個藥物治療新靶點，其抑制劑FK866可能是一個高效的抗膠質(zhì)瘤新型藥物，然而FK866在星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤中的作用方式和機(jī)制可能有一定的特異性