TP53基因改變影響MDM2抑制劑對神經膠質瘤的效應及機制研究.pdf

1、背景目的：
　　 神經膠質瘤是神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有生長迅速、浸潤性生長、惡性程度高、病程短、手術后易復發(fā)、預后很差等特點，嚴重威脅著人民群眾的健康。神經膠質瘤發(fā)生的原因以及發(fā)生發(fā)展的機制還有很多待研究之處。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因改變密切相關，而且存在一個基因改變和病變效應的不斷積累、演化的過程。而基因改變中，癌基因和腫瘤抑制基因發(fā)揮的作用最為關鍵。腫瘤細胞中癌基因可以通過多種方式異常激活，同樣，抑癌基因也可以通過多種方式

2、異常失活。同時，不同個體腫瘤又在基因改變、藥物敏感性上具有很大差異。抑癌基因TP53的表達產物p53蛋白在細胞周期的調控、細胞基因組完整性的維持、誘發(fā)細胞分化和凋亡中起著重要的作用。P53 信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著相當重要的作用。P53 信號通路在神經膠質瘤發(fā)生發(fā)展中也扮演著極其關鍵的作用。MDM2 對p53蛋白水平具有重要的調控作用，而且這種調控作用與TP53基因狀態(tài)密切相關，因此，本研究著重探討MDM2 特異性小分子抑制劑Nu

3、tlin-3對具有不同TP53基因狀態(tài)的神經膠質瘤的作用和機制，為Nutlin-3的臨床應用以及神經膠質瘤的個體化治療提供實驗依據。
　　 實驗方法：
　　 采用RT-PCR 方法克隆出神經膠質瘤細胞系U87、A172和U251中TP53基因轉錄出的cDNA，采用DNA測序方法確定其基因是否有改變。在此基礎上，應用Nutlin-3處理三種細胞，使用MTT 方法測定細胞活力，明確Nutlin-3 對三種細胞作用的差異；

4、r>　　 采用MTT法檢測Nutlin-3 聯(lián)合PI3K 抑制劑LY294002 應用對三種膠質瘤的作用。應用RT-PCR 定量方法確定三種細胞用藥前后p53以及p53 靶基因MDM2、BAX和P21 mRNA表達量的差異，應用Western-blot 方法檢測p53蛋白、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）
　　 和核增殖抗原（PCNA）用藥前后量的變化，應用Oligonucleotide pull-down 方法檢測三種細

5、胞中p53蛋白的DNA 結合活性。
　　 實驗結果：
　　 1、克隆到的TP53基因cDNA片段經測序后確定，神經膠質瘤細胞系U87中TP53基因沒有突變，屬于野生型；而A172 細胞系發(fā)生N239S 改變，U251 細胞系發(fā)生R273H改變。
　　 2、MTT 細胞活力測定實驗顯示：MDM2 抑制劑Nutlin-3能夠明顯抑制神經膠質瘤細胞U87（25 μM，抑制率為36.97％）、A172（25 μM，61.

6、41％）的生長，而對U251（25 μM，-18.27％）細胞沒有明顯作用；PI3K 抑制劑LY294002 對三種膠質瘤細胞在較高濃度下均有作用；Nutlin-3 聯(lián)合LY294002 處理，抑制神經膠質瘤細胞生長作用明顯強于單獨使用Nutlin-3 或LY294002。
　　 3、RT-PCR 半定量實驗顯示：使用Nutlin-3 處理前后，神經膠質瘤U251 細胞p53mRNA表達水平沒有明顯變化，而處理后U87、A172

7、 細胞中p53 mRNA表達水平顯著升高（p<0.01）；用藥處理前后，U251 細胞中p53 靶基因P21和BAXmRNA表達水平沒有太大變化，MDM2基因mRNA表達水平略有升高，但沒有統(tǒng)計學意義。而處理后U87 細胞中p53 靶基因MDM2，P21和BAXmRNA表達水平明顯升高（p<0.05）；A172細胞中p53 靶基因MDM2，P21 mRNA表達水平顯著升高（p<0.01），BAXmRNA表達水平明顯升高（p<0.05）。

8、
　　 4、Western-blot 實驗表明：無藥物處理時，神經膠質瘤U251 細胞中p53蛋白水平顯著高于U87和A172 細胞（p<0.01）；Nutlin-3 處理后，U251 細胞中p53蛋白水平略有提高但沒有統(tǒng)計學意義。而用藥處理后U87、A172 細胞中p53蛋白水平顯著升高（p<0.01），A172 細胞升高尤其顯著；藥物處理后，細胞凋亡標志蛋白PARP 在U87和U251 細胞中沒有明顯變化，而在A172 細胞

9、中檢測到少量caspase 切割后片段；細胞增殖標志蛋白PCNA 在U251和A172 細胞中的水平沒有明顯變化，而在U87 細胞中顯著降低（p<0.01）。
　　 5、Oligonucleotide pull-down 實驗顯示：U87 細胞中野生型p53能夠結合特定DNA序列，而且A172 細胞中N239S 改變型p53蛋白亦具備結合活性，只有U251 細胞中R273H 突變型p53蛋白不具備DNA 結合活性。
　　

10、 結論：
　　 1、神經膠質瘤細胞TP53基因狀態(tài)不同，MDM2 特異性小分子抑制劑Nutlin-3的作用有明顯差別，提示臨床治療依據TP53基因狀態(tài)決定MDM2 抑制劑使用的必要性。
　　 2、PI3K 抑制劑在較大濃度下對三種神經膠質瘤均有一定作用，MDM2 抑制劑聯(lián)合PI3K 抑制劑的作用明顯增加。
　　 3、A172 細胞中TP53基因的改變不影響MDM2 抑制劑的作用，說明該改變并沒有改變p53蛋白的功

11、能，Oligonucleotide pull-down 實驗進一步支持該結論。
　　 4、MDM2 抑制劑通過抑制神經膠質瘤細胞增殖（PCNA 改變）、促進神經膠質瘤細胞凋亡（BAX改變及PARP 變化）發(fā)揮作用。
　　 5、MDM2 抑制劑處理減少p53 降解，p53蛋白水平增加導致靶基因表達水平增加，增加的MDM2 會消掉MDM2 抑制劑的部分作用，而增加的P21 會進一步抑制MDM2的作用，提示p53-MDM2 反