Ⅰ型γ分泌酶抑制劑在惡性膠質(zhì)瘤放射增敏中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、前言 惡性膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦腫瘤,其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)及對(duì)放、化療的不敏感導(dǎo)致臨床治療相當(dāng)棘手。手術(shù)切除配合術(shù)后放療是目前最常用的治療手段,但療效差強(qiáng)人意,約70％的惡性膠質(zhì)瘤在術(shù)后1年復(fù)發(fā)[1-4]。究其因?yàn)?腫瘤難以徹底切除,殘留瘤細(xì)胞對(duì)后續(xù)放療的敏感性差是導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率高的主要因素。因此,如何提高惡性膠質(zhì)瘤的放療敏感性成為攻克這一腫瘤的主要努力方向。
　　 腫瘤細(xì)胞放射抗性的產(chǎn)生多與下列因素有關(guān):①腫瘤細(xì)胞超

2、強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力。部分腫瘤細(xì)胞高表達(dá)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白,能迅速修復(fù)受損DNA,因此對(duì)放射治療產(chǎn)生抗性[5]。②腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的抗凋亡能力[15]。惡性腫瘤細(xì)胞中某些促存活、抗凋亡通路及分子,如表皮生長(zhǎng)因子受體通路,PI3K-Akt通路,p53,Survivin等往往高表達(dá),致使腫瘤細(xì)胞抵抗射線誘導(dǎo)的凋亡。最近有文獻(xiàn)報(bào)道,Notch通路是促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療抗性的一條重要信號(hào)通路,而其機(jī)制正是通過(guò)上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Akt等抗凋亡通

3、路的表達(dá)[8]。因此削弱腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力,促進(jìn)其凋亡是惡性腫瘤放射增敏的主要策略之一。③腫瘤干細(xì)胞的放療抗性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞在惡性腫瘤的放射抵抗中發(fā)揮不可忽視的作用[13],其機(jī)制正與腫瘤干細(xì)胞超強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力及抗凋亡能力有關(guān)。存活下來(lái)的腫瘤干細(xì)胞成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。這一點(diǎn),我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也有類似發(fā)現(xiàn)。
　　 目前對(duì)腫瘤細(xì)胞放射增敏的研究已進(jìn)展到分子治療手段,例如針對(duì)放射敏感基因的小分子干擾RNA(

4、siRNA)、單克隆抗體[14]等。但這些方法都存在一些問(wèn)題--基因轉(zhuǎn)移效率低成為制約基因治療應(yīng)用的瓶頸；針對(duì)單一基因的治療在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中很難得到令人滿意的結(jié)果,等等[15]。這些都促使我們尋找一種新的更安全有效,且易于操作的放療增敏方法,而我們的研究工作發(fā)現(xiàn),γ分泌酶抑制劑(gamma secretase inhibitor,GSI)有望成為一類理想的放射增敏劑。
　　 GSI能抑制細(xì)胞內(nèi)γ分泌酶的活性。過(guò)去,人們對(duì)GSI的研究

5、多集中在阿爾茨海默病的治療上[16]。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn),GSI還具有很強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)[17],而這主要是通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。Notch信號(hào)通路已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān),如急性淋巴細(xì)胞性白血病[21,21]、卵巢癌[22]、乳腺癌[23]、髓母細(xì)胞瘤及惡性膠質(zhì)瘤等[24,25]。目前已被體外/體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抗腫瘤活性的GSI有多種[26-30],但有關(guān)GSI抗惡性膠質(zhì)瘤的研究還很少,特別是GSI在惡性腫瘤放射增敏

6、中的作用未見(jiàn)報(bào)道。因此,我們著手進(jìn)行該方面研究。
　　 目的以人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251細(xì)胞為主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)體內(nèi)/體外實(shí)驗(yàn),研究Ⅰ型γ分泌酶抑制劑(GSI-Ⅰ)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及放射增敏作用,并以CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞為切入點(diǎn),探討GSI-Ⅰ放射增敏的作用機(jī)制,為GSI的抗腫瘤效應(yīng)提供新證據(jù),為惡性膠質(zhì)瘤的臨床治療,特別是輔助放療提供新思路。
　　 方法 第一部分實(shí)驗(yàn)中,我們采用MTT法檢測(cè)梯度濃度

7、的GSI-Ⅰ對(duì)U87、U251細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的抑制作用,利用流式細(xì)胞術(shù)分析GSI-Ⅰ對(duì)U87、U251細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的作用,利用免疫印跡法及熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR等技術(shù)研究GSI-Ⅰ對(duì)U87、U251細(xì)胞中Notch信號(hào)通路及其下游一些細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,初步探討GSI-Ⅰ細(xì)胞毒作用的分子機(jī)制。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn)中,我們采用克隆形成實(shí)驗(yàn)分析低濃度GSI-Ⅰ對(duì)U87、U251細(xì)胞放射敏感性的影響；利用磁式細(xì)胞分

8、選技術(shù)(Magnetic Activated CellSorting,MACS)分離U87、U251細(xì)胞中的CD133+/CD133￣細(xì)胞,CD133+細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中,CD133￣細(xì)胞培養(yǎng)于含血清的MEM培養(yǎng)基中。分別研究低濃度GSI-Ⅰ對(duì)CD133+/CD133￣膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射增敏作用。利用熒光標(biāo)記的CD133抗體和流式細(xì)胞術(shù),分析GSI-Ⅰ對(duì)U87、U251細(xì)胞及1例原代培養(yǎng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CD133+細(xì)胞比

9、例的影響。采用體外成球?qū)嶒?yàn)及臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)分析GSI-Ⅰ對(duì)CD133+/CD133￣膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性作用。最后,利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)檢測(cè)GSI-Ⅰ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成瘤抑制作用及放射增敏作用。
　　 結(jié)果 第一部分實(shí)驗(yàn)主要研究GSI-Ⅰ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87及U251的細(xì)胞毒作用。MTT結(jié)果顯示,GSI-Ⅰ對(duì)U87及U251細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線有抑制作用,且隨著濃度與時(shí)間的增加而加大。進(jìn)一步研究表明,GSI-Ⅰ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性作用主要為

10、細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)凋亡:2.5μmol/L GSI-Ⅰ作用48h后,U87細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例從43.8±1.99％增加至52.96±1.36％(P=0.003),而S期細(xì)胞比例從24.81±1.5％減少為9.34±0.53％(P=0.000),G2期細(xì)胞比例略有增加；U251細(xì)胞則觀察到在G1期、S期細(xì)胞比例下降的同時(shí),G2期細(xì)胞比例大幅增加(從10.43±1.39％到46.97±2.24％,P=0.000)；在誘導(dǎo)凋亡方面,1μmo

11、l/LGSI-Ⅰ作用24h或48h,U87細(xì)胞的凋亡率較低,分別為2.8±0.48％和2.99±0.55％；U251細(xì)胞的凋亡率稍高,分別為3.85±0.52％和9.22±0.25％；2.5μmol/LGSI-Ⅰ作用48h后,U87細(xì)胞的凋亡率達(dá)到10.29±0.94％,U251細(xì)胞的凋亡率則高達(dá)22.99±0.94％。
　　 為探索GSI-Ⅰ細(xì)胞毒作用的可能機(jī)制,我們采用RT-PCR、qRT-PCR及Western Blot技

12、術(shù)檢測(cè)GSI-Ⅰ對(duì)細(xì)胞內(nèi)Notch信號(hào)通路的阻斷作用及對(duì)一些細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果顯示,Notch-2、Notch-3在U87、U251細(xì)胞中表達(dá)；GSI-Ⅰ作用12-24小時(shí)即可降低Notch靶基因Hes-1的表達(dá),證明GSI-Ⅰ對(duì)Notch通路有阻斷作用。GSI-Ⅰ作用后兩種細(xì)胞的抗凋亡蛋白Akt及S6K的磷酸化程度略有降低。U87細(xì)胞的Cyclin D1表達(dá)下調(diào),U251細(xì)胞的CyclinB1表達(dá)下調(diào),兩種細(xì)胞的CDK

13、2都有明顯下調(diào)。說(shuō)明GSI-Ⅰ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的抗凋亡及細(xì)胞周期蛋白的活性及表達(dá)有影響。這可能是GSI-Ⅰ抗膠質(zhì)瘤效應(yīng)的分子機(jī)制之一。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn)主要探討 GSI-Ⅰ的放射增敏作用及體內(nèi)抗腫瘤作用?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示,低濃度GSI-Ⅰ對(duì)U87、U251細(xì)胞有顯著的放射增敏作用。為探討放射增敏機(jī)制,我們用Western Blot技術(shù)檢測(cè)與DNA修復(fù)有關(guān)的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)蛋白CHK1、CHK2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)無(wú)影響；檢測(cè)抗凋亡蛋白Ak

14、t的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)放射后Akt磷酸化水平增加,在GSI-Ⅰ的作用下則明顯降低,提示抑制Akt的活性可能參與GSI-Ⅰ的放射增敏作用。
　　 我們還發(fā)現(xiàn),CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的放射抗性要高于CD133￣膠質(zhì)瘤細(xì)胞,而GSI-Ⅰ則顯著降低CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的放射抗性。流式細(xì)胞分析顯示,放射后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的CD133+細(xì)胞比例大幅增加,而1μmmol/L GSI-Ⅰ作用24小時(shí)可顯著減少CD133+細(xì)胞比例,提示GSI-Ⅰ

15、通過(guò)消除CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞達(dá)到放射增敏的效應(yīng)。體外成球?qū)嶒?yàn)顯示,GSI-Ⅰ可明顯抑制CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體外成球能力。臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)顯示,1 μmmol/L GSI-Ⅰ對(duì)CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性大于CD133￣膠質(zhì)瘤細(xì)胞,而隨著GSI-Ⅰ濃度的增加,它對(duì)CD133+/CD133￣膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性作用無(wú)差異。說(shuō)明低濃度GSI-Ⅰ可靶向抑制CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示,CD133+U87細(xì)胞中Notch-2

16、、Notch-3受體及靶基因Hes-1的表達(dá)水平明顯高于CD133￣細(xì)胞,提示GSI-Ⅰ的靶向抑制CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能與此有關(guān)。
　　 裸鼠實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)1 μmmol GSI-Ⅰ處理的U87細(xì)胞,其體內(nèi)成瘤能力下降,瘤體積比對(duì)照組小。對(duì)正常U87細(xì)胞成瘤的瘤組織,瘤周注射GSI-Ⅰ,可導(dǎo)致瘤組織大片壞死。免疫組化染色結(jié)果顯示,GSI-Ⅰ能顯著降低移植瘤細(xì)胞中Hes-1和Nestin的表達(dá),說(shuō)明Notch信號(hào)通路被阻斷且腫瘤