ROS在Bcl-2抑制劑抗淋巴瘤和肝細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療最基本的理念之一,Bcl-2家族抗凋亡蛋白作為目前研究最深入的調(diào)控線粒體途徑凋亡的一類分子,其靶向抑制劑的開發(fā)和機(jī)制研究成為了近年來的熱點。靶向Bcl-2家族抗凋亡蛋白的小分子化合物在許多臨床前期實驗中已被證實具有較好的抗瘤效應(yīng)。淋巴瘤和肝癌作為我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤,死亡率較高,目前的治療措施效果不夠理想,副作用較大,急需靶向性較強(qiáng)的藥物。前期大量研究已經(jīng)證實淋巴瘤和肝癌的發(fā)生、發(fā)展及治療

2、抵抗均與Bcl-2家族抗凋亡蛋白的過表達(dá)密切相關(guān),是應(yīng)用Bcl-2抑制劑進(jìn)行靶向治療的理想模型。ROS是細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的活性氧簇,密切參與了多種生理及病理過程的調(diào)節(jié)。近年來ROS在調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡中的雙重作用越來越受到關(guān)注,但有關(guān)Bcl-2抑制劑誘導(dǎo)的ROS在抗癌中的具體作用和機(jī)制還不清楚,亟待深入闡明。
　　研究目的:
　　ROS在Bcl-2抑制劑抗淋巴瘤和肝細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制研究。
　　研究方法:

3、　　選取人淋巴瘤細(xì)胞系Namalwa和肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7、Hep3B和PLC/PRF/5為細(xì)胞模型。將不同濃度的Bcl-2抑制劑在不同時間點處理細(xì)胞后,采用CCK-8檢測細(xì)胞存活率,臺盼藍(lán)計數(shù)細(xì)胞總的死亡率,TUNEL-FITC檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量,Westernblot檢測凋亡相關(guān)分子變化,ELISA試劑盒檢測Caspase3酶活性變化。用Bcl-2抑制劑處理細(xì)胞后,Westernblot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和P62變化,并

4、用熒光顯微鏡觀察GFP-LC3形成自噬小體情況,DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)總ROS的變化。Bcl-2抑制劑單獨或聯(lián)合抗氧化劑NAC或JNK抑制劑處理細(xì)胞后,Annexin-PI染色觀察細(xì)胞凋亡變化,Westernblot檢測凋亡及自噬相關(guān)分子的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.ROS在左旋棉酚抗淋巴瘤中的作用及機(jī)制。
　　(1)左旋棉酚劑量依賴性地抑制淋巴瘤Namlaw細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的死亡;(2)左旋棉酚能升

5、高Namlaw細(xì)胞內(nèi)的ROS水平;
　　(3)抗氧化劑NAC可抑制左旋棉酚誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬;
　　(4)抗氧化劑NAC阻止左旋棉酚介導(dǎo)的HMGB1從胞核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位;
　　(5)抗氧化劑NAC顯著促進(jìn)了左旋棉酚的促細(xì)胞凋亡能力。
　　2.ROS在新型棉酚衍生物ApoG2抗肝細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制。
　　(1)ApoG2誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B的自噬發(fā)生;
　　(2)ApoG2打斷了Belin1

6、和Bcl-2之間的相互作用;
　　(3)ApoG2促進(jìn)了HepG2和Hep3B細(xì)胞ROS的升高;
　　(4)ApoG2誘導(dǎo)的自噬能被抗氧化劑NAC所拮抗;
　　(5)抗氧化劑NAC增強(qiáng)了ApoG2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。
　　3.ROS在ABT-737抗肝細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制。
　　(1)高表達(dá)Bcl-2和Bcl-xl的HepG2和Hep3B細(xì)胞系對ABT-737不敏感,而高表達(dá)Bcl-xl但無表達(dá)或低表達(dá)Bc

7、l-2的肝癌細(xì)胞系對ABT-737較為敏感;
　　(2)ABT-737在HepG2細(xì)胞更容易誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生;
　　(3)ABT-737在HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞均誘導(dǎo)了ROS的升高,在Huh7細(xì)胞變化更為明顯;
　　(4)ABT-737通過ROS差異性地激活了JNK,ABT-737在HepG2細(xì)胞早期瞬時激活JNK,而在Huh7細(xì)胞則持續(xù)激活JNK;
　　(5)在HepG2細(xì)胞,ABT-737聯(lián)合抗氧化劑N

8、AC或JNK抑制劑SP600125均抑制了細(xì)胞自噬水平,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡;在Huh7細(xì)胞,抗氧化劑NAC或JNK抑制劑SP600125均抑制了ABT-737誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　(1)左旋棉酚能通過ROS誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,這種自噬是利于細(xì)胞存活的,抗氧化劑能通過抑制自噬促進(jìn)左旋棉酚誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;ROS介導(dǎo)自噬發(fā)生可能與胞核HMGB1向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位增加有關(guān)。
　　(2)ApoG2能通過ROS誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)

9、生保護(hù)性自噬,其機(jī)制涉及ROS介導(dǎo)的ERK和JNK通路激活以及胞核HMGB1向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位增加;抗氧化劑NAC能增強(qiáng)ApoG2的抗瘤效應(yīng)。
　　(3)不同肝癌細(xì)胞系對ABT-737的敏感性不同,ROS-JNK通路的激活程度不同是造成這種差異性的重要原因。在高表達(dá)Bcl-2的HepG2細(xì)胞,ABT-737通過激活低水平的ROS在早期瞬時激活了JNK;在低表達(dá)Bcl-2的Huh7細(xì)胞則通過激活高水平的ROS持續(xù)激活了JNK;ABT-73