熱休克蛋白90抑制劑17-AAG抗腎細(xì)胞癌作用的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 HIF-2α、Hsp90和VEGF在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義 目的:研究腎細(xì)胞癌中缺氧誘導(dǎo)因子2(HIF-2α)、熱休克蛋白90(Hsp90)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)及與臨床病理特征之間的關(guān)系，并探討三者之間及與腎細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系。 方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)(IHC)S-P法檢測60例腎細(xì)胞癌及25例正常腎組織中HIF-2α、Hsp90和VEGF表達(dá)與分布，分析其間的相關(guān)性及與腫瘤臨床病理特征之

2、間的聯(lián)系，根據(jù)隨訪資料探討上述三者與腎細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡(western blot)法檢測HIF-2α及VEGF mRNA的表達(dá)。 結(jié)果:免疫組化S-P法檢測中腎細(xì)胞癌標(biāo)本HIF-2α、Hsp90和VEGF的表達(dá)明顯高于正常腎組織，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。三個指標(biāo)之間，兩兩呈顯著正相關(guān)。HIF-2α、Hsp90和VEGF的表達(dá)與腎癌的分期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及局部侵潤有關(guān)。上述三者

3、與腎細(xì)胞癌患者生存期之間關(guān)系的分析提示HIF-2α陰性組腎細(xì)胞癌患者的生存率高于陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Hsp90陰性組生存率有高于陽性組的趨勢，接近于統(tǒng)計學(xué)水平，VEGF陽性組病例的預(yù)后顯著差于陰性組，有統(tǒng)計學(xué)意義。RT-PCR和western blot法檢測中HIF-2α只在蛋白水平增高，VEGF在mRNA和蛋白水平均增高。 結(jié)論:在人腎細(xì)胞癌中HIF-2α、Hsp90和VEGF基因高表達(dá)，且HIF-2α、Hsp90和VE

4、GF三者表達(dá)之間有顯著正相關(guān)。HIF-2α和VEGF是影響腎細(xì)胞癌預(yù)后的獨立因素。HIF-2α可能通過上調(diào)VEGF表達(dá)而在腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Hsp90與HIF-2α密切相關(guān)，可能二者在腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中共同作用。 第二部分 Hsp90抑制劑17-AAG對人腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外研究 目的:觀察Hsp90抑制劑17-AAG對體外培養(yǎng)的人腎癌細(xì)胞株Caki-1細(xì)胞的作用。 方法:將Hsp90抑制

5、劑17-AAG加入人腎癌細(xì)胞株Caki-1中(實驗組)，分別在常氧和缺氧狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)。同時設(shè)立陰性對照組和空白對照組。MTT法檢測三組細(xì)胞增殖能力。Hoechst33342和PI雙染法觀察細(xì)胞凋亡，AnnexinV-FITC/PI雙染法和DNA ladder檢測細(xì)胞凋亡。western blot法檢測HIF-2α和VEGF蛋白表達(dá)。 結(jié)果:對數(shù)生長周期的三組細(xì)胞在常氧狀態(tài)下的增殖活性無明顯區(qū)別。而實驗組細(xì)胞在缺氧48小時后生長

6、能力逐漸下降，細(xì)胞增殖明顯滯后于前兩組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。缺氧狀態(tài)下實驗組的凋亡率明顯增高，而陰性對照組和空白對照組細(xì)胞的凋亡率盡管也增多，但增高幅度較小，與實驗組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。常氧狀態(tài)下，實驗組細(xì)胞HIF-2α和VEGF蛋白表達(dá)受到抑制，明顯低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在模擬缺氧24小時后，陰性對照組和空白對照組的HIF-2α和VEGF蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，與常氧時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而實驗組細(xì)胞HIE-

7、2α和VEGF蛋白表達(dá)雖然有所增加，但幅度較小，與常氧時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論:在體外，Hsp90抑制劑17-AAG能抑制Caki-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，并能抑制人腎癌細(xì)胞株Caki-1的HIF-2α和VEGF基因表達(dá)。 第三部分 Hsp90抑制劑17-AAG對人腎細(xì)胞癌抑制作用的體內(nèi)研究 目的:在整體水平(裸鼠皮下移植瘤)研究Hsp90抑制劑17-AAG對人腎細(xì)胞癌生長的作用。 方法:建立人腎細(xì)胞

8、癌裸鼠皮下移植瘤模型，在模型中按125mg/kg體重標(biāo)準(zhǔn)，在瘤體內(nèi)分別注射17-AAG、DMSO和生理鹽水，觀察抑瘤效果，IHC S-P法檢測HIF-2α和VEGF蛋白表達(dá)，TUNEL和透視電鏡檢測凋亡。 結(jié)果:實驗組裸鼠皮下移植瘤的生長明顯受到抑制。體積增長明顯慢于空白對照組和陰性對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。同時重量明顯輕于空白對照組和陰性對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組裸鼠皮下移植瘤HIF-2α和VEGF蛋白表達(dá)弱于對照組，差