氯化鈷對Walker256細(xì)胞HSP90的表達(dá)及其抑制劑17-AAG對細(xì)胞凋亡和生長影響.pdf

1、目的：
　　觀察氯化鉆(CoCl2)在體外模擬低氧對肝癌Walker256細(xì)胞形態(tài)的改變及增殖能力的影響，進(jìn)一步確立合適的肝癌Walker256細(xì)胞的體外缺氧模型。并在該缺氧模型基礎(chǔ)上觀察不同程度缺氧對肝癌Walker256細(xì)胞中HSP90蛋白的表達(dá)能力的影響，并探討可能的影響機(jī)制。
　　方法：
　　1.倒置顯微鏡法觀察不同濃度的CoCl2(0、50、100、200、300、500μmol/L)和不同濃度的17-AAG

2、(0、0.1、0.25、0.5、1、2μmol/L)分別處理肝癌Walker256細(xì)胞48h后，觀察其細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　2.MTT法測定不同濃度COCl2（0、50、100、200、300、500μmol/L）和不同濃度的17-AAG抑制劑(0、0.1、0.25、0.5、1、2μmol/L)分別經(jīng)不同的時(shí)間段處理肝癌Walker256細(xì)胞，來檢測其增殖能力的影響。
　　3.蛋白免疫印跡(Western Blot)法分別檢

3、測不同濃度的CoCl2(0、50、100、200、300、500μmol/L)和0.5μmol/L17-AAG作用于Walker256細(xì)胞后，對細(xì)胞中HSP90及Bcl-2表達(dá)的影響。
　　4.Annexin-FITC/PI流式細(xì)胞雙染技術(shù)檢測17-AAG對肝癌Walker256細(xì)胞的凋亡的影響。
　　5.用Walker256細(xì)胞的細(xì)胞懸液建立大鼠種植瘤模型，并將成瘤實(shí)驗(yàn)大鼠分為經(jīng)腹腔給予17-AAG和不給予17-AAG兩組

4、（各組15只大鼠），觀測比較兩組大鼠種植瘤的平均體積。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的CoCl2對細(xì)胞具有一定程度的增殖抑制作用。300μmol/L和500μmol/LCoCl2作用于細(xì)胞，鏡下觀察可見大量細(xì)胞碎片，細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯的皺縮。Western Blot結(jié)果顯示CoCl2處理細(xì)胞48h后，能夠上調(diào)HSP90的表達(dá)，該作用具有濃度依賴性。
　　2.不同濃度的HSP90抑制劑17-AAG對Walker256細(xì)胞的增

5、殖抑制作用具有時(shí)間和劑量的依賴性。17-AAG對細(xì)胞形態(tài)也有影響，對照組Walker256細(xì)胞飽滿呈圓形，胞質(zhì)豐富，大小均一，包膜完整，而經(jīng)17-AAG作用48 h后的Walker256細(xì)胞則明顯減少，細(xì)胞邊緣模糊、形態(tài)差，部分細(xì)胞包膜破裂。Annexin-FITC/PI染色法檢測分析結(jié)果顯示:①與常氧組相比低氧組細(xì)胞凋亡比率無明顯差異(P＞0.05）;②與常氧組相比較17-AAG+常氧組細(xì)胞凋亡比率增加（P＜0.05）;③與低氧組相比

6、17-AAG+低氧組細(xì)胞凋亡比率增加(P＜0.05);④與17-AAG+低氧組相比17-AAG+常氧組細(xì)胞凋亡比率增加(P＜0.05)。
　　同時(shí)通過Wester Blot檢測分析結(jié)果顯示:①與常氧組相比，低氧組的HSP90和Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05）;②與常氧組相比，17-AAG+常氧組的HSP90和Bcl-2表達(dá)受到抑制(P＜0.05);③與低氧組相比，17-AAG+低氧組的HSP90和Bcl-2表達(dá)也受到抑制(P＜0

7、.05）;④17-AAG+低氧組與17-AAG+常氧組相比，HSP90和Bcl-2的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.17-AAG抑制劑能夠明顯抑制大鼠種植瘤的生長，隨著給藥時(shí)間的延長，發(fā)現(xiàn)給藥組大鼠種植瘤生長較對照組明顯緩慢，對照組大鼠種瘤平均體積始終呈增長的趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.不同濃度的CoCl2能誘導(dǎo)HSP90的表達(dá)，當(dāng)CoCl2在200μmol/L的劑量時(shí)誘導(dǎo)作用最為明顯。
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