Survivin抑制劑YM155及其聯(lián)合用藥對T-24細(xì)胞生長影響及機(jī)制研究.pdf

1、　　目的：(1)本研究旨在觀察單用或聯(lián)合YM155和TRAIL對人膀胱癌細(xì)胞體外增殖作用的影響,評估其誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用。(2)為YM155基礎(chǔ)上的聯(lián)合用藥在膀胱癌治療中的臨床應(yīng)用研究提供實驗依據(jù)和理論支持。
　　方法：分別單用不同濃度的YM155、TRAIL和5-Fu處理T-24細(xì)胞：YM155的各工作濃度分別為：1 、5、10、50、100、500、1000 nmol/L,TRAIL的各工作濃度分別為：1、3、10、

2、30、100、300、1000ng/ml,5-Fu的各工作濃度分別為：200、400、600、800和1000umol/ml,每種濃度設(shè)置4個復(fù)孔,空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液,分別作用24,48和72小時。(2)聯(lián)合應(yīng)用TRAIL和YM155,配制混合藥液中TRAIL的濃度分別為3、10、30、100、300ng/ml,而YM155的濃度均為5nmol/L,一組將混合藥液按上述方法加入培養(yǎng)孔,另一組相應(yīng)加入等體積同濃度的TRAIL藥液

3、,每種濃度設(shè)置4個復(fù)孔,作用48小時。應(yīng)用MTT法測定不同濃度的單一藥物、不同濃度的聯(lián)合藥物以及同一濃度的同一藥物作用不同時間后對T-24細(xì)胞生長的影響情況,繪制曲線,分析結(jié)果。(3)將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞經(jīng)不同濃度的YM155藥液( 0、10、100、1000nmol/L)處理后,用RT-PCR和Western Blot方法檢測各組中的survivin mRNA和Survivin蛋白含量。(4)流式細(xì)胞儀測定YM155對膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞

4、凋亡率和細(xì)胞周期,以驗證其增強細(xì)胞毒性是激活細(xì)胞凋亡的特異機(jī)制。
　　結(jié)果：(1)單藥和聯(lián)合用藥后檢測不同濃度的不同藥物對T-24細(xì)胞生長的影響情況：不同濃度YM155作用24小時后能明顯抑制T-24細(xì)胞生長,50nmol/L濃度的藥物即可抑制近50%細(xì)胞生長,1000nmol/L作用最強,最大抑制率可達(dá)65%；48小時后抑制率較24小時有升高：10nmol/L的藥物即可抑制近45%細(xì)胞生長,500nmol/L時細(xì)胞生長抑制率可

5、達(dá)77.12.；72小時后其抑制率進(jìn)一步升高,10nmol/L時抑制率達(dá)57.84%, 最高濃度時抑制率達(dá)到85%,相同作用時間內(nèi)隨藥物濃度不斷上升,各組T-24細(xì)胞生存率呈現(xiàn)明顯下降趨勢(P<0.01)。5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L5種濃度的YM155隨著作用時間的延長,T-24細(xì)胞生存率也呈現(xiàn)出明顯下降趨勢(P<0.05)。七種濃度的TRAIL對T-24作用24小時

6、和48小時后細(xì)胞的生存率改變均不明顯,所有濃度中最大抑制率不過20%,72小時后也只有1、300和1000ng/ml三種濃度處理后生長抑制率達(dá)到20%以上,最大達(dá)26.12%,1ng/ml和1000ng/ml的藥物隨作用時間的延長細(xì)胞生存率呈現(xiàn)明顯下降趨勢,且同一作用時間內(nèi)不同濃度梯度藥物之間細(xì)胞的生存率沒有明顯的差異(P>0.05)；陽性對照組中五個濃度(200umol/ml、400 umol/ml、600 umol/ml、800 u

7、mol/ml和1000 umol/ml)的5-Fu分別對T-24細(xì)胞作用24小時后細(xì)胞的生長抑制率依次升高(P<0.05),最高達(dá)48%,48小時和72小時呈現(xiàn)出同樣的趨勢,最高抑制率分別達(dá)到31.18%和64.36%,400 umol/ml、600 umol/ml和1000umol/ml濃度組隨作用時間的延長,細(xì)胞的生長抑制率有明顯上升趨勢(P<0.05)。(2)5nmol/L YM155分別和TRAIL(3、10、30、100、30

8、0ng/ml)聯(lián)合處理48小時后細(xì)胞的生長抑制率不斷升高(P<0.05),最高達(dá)76.21%,而未聯(lián)合YM155時最高抑制率僅為21.02%,二者存在明顯的差異(P<0.01)。(3)分別用0、10、100、1000nmol/L 4種濃度的YM155處理T24細(xì)胞48小時后用RT-PCR技術(shù)檢測survivin的核酸含量結(jié)果顯示：隨藥物濃度的升高,細(xì)胞內(nèi)survivin的核酸含量不斷降低(P<0.05)。分別用0、10、100、1000

9、nmol/L 4種濃度的YM155處理T-24細(xì)胞48小時后用免疫印跡技術(shù)檢測Survivin的蛋白含量結(jié)果顯示隨藥物濃度的上升,不同細(xì)胞組中Survivin蛋白含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(P<0.05)。
　　結(jié)論：(1)YM155單獨作用可以顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的生長,最佳作用濃度范圍為5-100nmol/L,該殺傷作用呈濃度依賴性和時間依賴性；(2)TRAIL單獨作用對T-24細(xì)胞的殺傷作用不明顯,即T-24細(xì)胞對TRAIL耐藥；