酪氨酸激酶抑制劑在外周T細胞淋巴瘤細胞株增殖中作用及其機制研究.pdf

1、外周T細胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphomas，PTCLs)是指成熟T細胞、胸腺后T細胞及自然殺傷(NK)細胞來源的惡性血液病，異質(zhì)性高，病情發(fā)展快，是侵襲能力最高的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，約占NHL的15％，該疾病具有地域性特征，亞洲人群發(fā)病高于歐美國家，通常原發(fā)于咽喉或鼻腔部分，少數(shù)原發(fā)于皮膚，目前尚無標準化療方案，傳統(tǒng)的CHOP或CHOP樣方案仍被廣泛應用，化療效果差，易復發(fā)，長期生存率僅為10％-30

2、％，預后不良。
　　T細胞受體(T-cell receptor，TCR)信號通路在T細胞發(fā)生過程及其功能發(fā)揮中有重要作用，并與外周T細胞淋巴瘤的發(fā)病密切相關。ITK(Interleukin-2(IL-2)-inducible T cell kinase）是TCR通路的關鍵酶，在PTCLs組織中的表達明顯高于淋巴結炎組織，與PTCLs的惡性程度及腫瘤轉移有關，可用于疾病診斷及病情預后，是非常有潛力的抑制靶點。
　　BTK、IT

3、K、Syk是非受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶TEC家族的重要成員，與免疫細胞的分化、發(fā)育、增殖及凋亡密切相關，其過度激活或過度表達是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的機制之一。依魯替尼是布魯頓酪氨酸激酶(Bruton's tyrosinekinase，BTK)不可逆的抑制劑，通過與BTK的活性位點半胱氨酸殘基(Cys-481)選擇性結合形成共價鍵抑制BTK的自我磷酸化激活。目前依魯替尼主要應用于B細胞腫瘤的治療，在針對CLL、MCL、MM的臨床實驗中具有非常好的

4、療效，臨床應用前景可觀。同時，依魯替尼被證實對ITK也有不可逆的抑制作用。
　　目前，國內(nèi)外還未見依魯替尼對PTCLs調(diào)控作用的報道。本研究中，我們通過研究依魯替尼在PTCLs細胞株KARPAS-299 and HUT-78中的毒性作用及其作用機制，探討外周T細胞淋巴瘤的治療的新藥物。
　　目的:
　　檢測依魯替尼對外周T細胞淋巴瘤細胞株（HUT-78及KARPAS-299）增殖及凋亡的調(diào)控，并探討Wnt通路在其中的作

5、用，為外周T細胞淋巴瘤的治療提供新的方法及思路。
　　方法:
　　1.設立藥物濃度梯度（0，1，10，20，50，100μmol）作用于HUT-78及KARPAS-299、正常人T細胞，采用CCK-8法檢測細胞增殖抑制率，觀察依魯替尼對PTCLs細胞株及正常人T細胞增殖的影響。
　　2.相差顯微鏡觀察不同藥物濃度（0，10μmol）處理后細胞形態(tài)學改變。
　　3.設立藥物濃度梯度(0，1，10，20μmol)，相

6、差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，采用AnnexinⅤ-PI/FITC細胞凋亡雙染試劑盒測定依魯替尼處理后的細胞凋亡率，觀察依魯替尼對PTCLs細胞凋亡的影響。
　　4.采用RT-PCR檢測依魯替尼處理后細胞（藥物濃度為0，1，10μmol）β-catenin及LEF-1基因mRNA的表達水平的變化，觀察依魯替尼對β-catenin及LEF-1基因表達的影響。
　　5.采用Western blot檢測依魯替尼處理后細胞(藥物濃度為

7、0，1，10，20μmol)β-catenin及LEF-1蛋白水平表達的變化，觀察依魯替尼對β-catenin及LEF-1蛋白表達的影響。
　　結果:
　　1.依魯替尼處理HUT-78及KARPAS-299、正常人T細胞細胞后，兩種腫瘤細胞的增殖均被明顯抑制(IC50分別為13.34μmol及19.05μmol)(p＜0.01)，旱藥物濃度依賴性及時間依賴性。正常人T細胞增殖未受明顯抑制(p＞0.05)。
　　2.依魯

8、替尼處理HUT-78及KARPAS-299細胞后，兩種細胞的細胞團減小，細胞數(shù)目減少，異形細胞增多。
　　3.依魯替尼處理HUT-78及KARPAS-299細胞后，兩種細胞的凋亡率均明顯升高(p＜0.01)，呈藥物濃度依賴性。
　　4.依魯替尼處理HUT-78及KARPAS-299細胞后，兩種細胞的β-catenin及LEF-1基因在mRNA水平的表達被明顯抑制(p＜0.05)，呈藥物濃度依賴性及時間依賴性。
　　5.