東莨菪內(nèi)酯對朱砂葉螨Ca2+-ATP酶的抑制作用及靶標(biāo)位點預(yù)測.pdf

1、朱砂葉螨繁殖力強，世代周期短，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅我國農(nóng)林業(yè)的生產(chǎn)與發(fā)展的有害生物。盡管害螨防治的方法很多，但在可預(yù)見的未來，使用殺螨劑進(jìn)行害螨防治仍是主要的措施之一，化學(xué)藥劑的長期使用導(dǎo)致“3R”問題日趨嚴(yán)重，因此尋找并開發(fā)具有多靶標(biāo)位點、高效低毒的新型殺螨活性物質(zhì)是解決當(dāng)前問題的有效手段。與化學(xué)殺螨劑相比，植物源殺螨劑已成為篩選新型殺螨劑的重要選擇，具有作用方式獨特、作用位點新穎、對非靶標(biāo)生物安全以及環(huán)境污染小等特點。研究發(fā)現(xiàn)，源于

2、黃花蒿(Artemisia annua)的活性物質(zhì)東莨菪內(nèi)酯，表現(xiàn)出良好的殺螨活性，具有植物源殺螨劑的開發(fā)價值。根據(jù)文獻(xiàn)報道及本課題前期研究表明，受東莨菪內(nèi)酯處理的朱砂葉螨出現(xiàn)明顯的神經(jīng)毒劑癥狀，并推測Ca2+-ATP酶可能是東莨菪內(nèi)酯的主要作用靶標(biāo)之一。本文立足于尋找新的殺螨劑品種，充分挖掘東莨菪內(nèi)酯的開發(fā)潛力，實現(xiàn)其靶標(biāo)定位，闡明其殺螨作用機理，酶活性部位的結(jié)構(gòu)以及酶分子與東莨菪內(nèi)酯結(jié)合的情況，為東莨菪內(nèi)酯的后續(xù)開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)

3、。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴表征了朱砂葉螨Ca2+-ATP酶的生物學(xué)特性，包括最適溫度、pH以及常見酶激活劑的影響，測定了東莨菪內(nèi)酯對朱砂葉螨Ca2+-ATP酶的離體抑制效果。朱砂葉螨Ca2+-ATP酶的最適溫度為35～38℃，最適pH為6.8～7.2，同時初步確定了常見酶激活劑Mg2+，Mn2+，Ca2+，Na+，K+，Cu2+，Zn2+，Co2+金屬離子對Ca2+-ATP酶起激活作用的較適濃度。東莨菪內(nèi)酯殺螨活性良好，24h

4、內(nèi)對朱砂葉螨雌成螨的致死中濃度(LC50)為1.142mg/mL。在不同濃度的東莨菪內(nèi)酯作用下，朱砂葉螨Ca2+-ATP酶活性受到抑制，其中，在東莨菪內(nèi)酯濃度為31μM時抑制效果最明顯，酶活性降為原來的20％。通過對酶動力學(xué)常數(shù)Km和Vm的比較，結(jié)果表明，在東莨菪內(nèi)酯作用下Ca2+-ATP酶的Km和Vm值分別是原來的1.52倍和0.66倍，說明在東莨菪內(nèi)酯作用下酶與底物的親和性減小，這可與東莨菪內(nèi)酯對Ca2+-ATP酶活性的抑制作用有關(guān)

5、。
　　⑵研究了東莨菪內(nèi)酯脅迫下朱砂葉螨Ca2+-ATP酶基因的表達(dá)量變化。不同濃度的東莨菪內(nèi)酯脅迫下朱砂葉螨Ca2+-ATP酶基因表達(dá)量的結(jié)果顯示，朱砂葉螨四條不同亞型的Ca2+-ATP酶基因均產(chǎn)生了明顯的應(yīng)激反應(yīng)，其中TcPMCA1，TcPMCA2, TcSPMCA2三條基因表達(dá)量均顯著升高，而TcSERCA1基因表達(dá)量整體上表現(xiàn)為先降后升的趨勢。從時間和劑量效應(yīng)來看，TcPMCA1基因?qū)|莨菪內(nèi)酯表現(xiàn)的最為敏感，經(jīng)1.25m

6、g/mL東莨菪內(nèi)酯誘導(dǎo)處理8h后基因表達(dá)量達(dá)到原來的142倍，24h后達(dá)到原來的119倍;TcPMCA2、TcSPMCA2和TcSERCA1基因的最高表達(dá)量分別為原來的73倍、70倍和140倍。由此推測，東莨菪內(nèi)酯的殺螨作用與Ca2+-ATP酶的TcPMCA1基因密切相關(guān)。
　　⑶克隆了與東莨菪內(nèi)酯作用靶標(biāo)有關(guān)的朱砂葉螨TcPMCA1基因全長，并進(jìn)行了表達(dá)模式分析。成功克隆并獲得了朱砂葉螨Ca2+-ATP酶PMCA1基因的cDNA

7、序列，命名為TcPMCA1，GenBank登陸號為KP455490。TcPMCA1全長4369bp，開放閱讀框為3750bp，起始密碼子ATG，終止密碼子TGA，編碼1249個氨基酸。預(yù)測蛋白質(zhì)分子量和等電點分別為137.7KD和8.10，偏堿性。跨膜域預(yù)測結(jié)果顯示，TcPMCA1包含有10個跨膜結(jié)構(gòu)域(TM1～TM10)。進(jìn)化分析表明，與朱砂葉螨TcPMCA1親緣關(guān)系最近的是二斑葉螨(Tetmnychus urticae)，其次是肩板

8、硬蜱(Ixodes scapularis)，與線蟲綱的物種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。表達(dá)模式分析表明，TcPMCA1基因在螨的不同發(fā)育階段均有表達(dá)，其表達(dá)量大小順序為若螨＞幼螨＞成螨＞卵。
　　⑷構(gòu)建了朱砂葉螨TcPMCA1蛋白亞基的三維模型，推測了東莨菪內(nèi)酯小分子與TcPMCA1蛋白亞基的結(jié)合位點。通過對PDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTx搜索，最終選擇以家兔Ca2+-ATP酶為模板，構(gòu)建TcPMCA1蛋白三維空間結(jié)構(gòu)模型。對該模型進(jìn)行立體構(gòu)象分析

9、發(fā)現(xiàn)，該蛋白亞基存在三個活性結(jié)合腔，分別對應(yīng)蛋白質(zhì)的N-域、A-域和P-域。采用Autodock軟件進(jìn)行分子對接，獲得了東莨菪內(nèi)酯在TcPMCA1活性結(jié)合腔中的結(jié)合構(gòu)象，東莨菪內(nèi)酯與TcPMCA1的活性結(jié)合腔B即蛋白質(zhì)的執(zhí)行域（A-域）的活性位點發(fā)生結(jié)合，其中東莨菪內(nèi)酯的羰基和鄰近的芳環(huán)位于通往蛋白質(zhì)催化活性域活性位點的通道入口處，而化合物小分子的其余部分則嵌入到通道中。構(gòu)象分析表明，東莨菪內(nèi)酯主要與TcPMCA1催化活性中心的三個氨基

10、酸殘基發(fā)生了相互作用。其中，東莨菪內(nèi)酯的11位羰基氧原子與丙氨酸Ala-298位氨基酸殘基發(fā)生氫鍵作用，結(jié)合能為2.93，13位的甲氧基的氧原子與賴氨酸Lys-301位氨基酸殘基發(fā)生氫鍵作用，結(jié)合能為2.99，而化合物的其他部分則與半胱氨酸Cys-299位氨基酸殘基發(fā)生π-π共軛效應(yīng)。
　　⑸系統(tǒng)研究了東莨菪內(nèi)酯對朱砂葉螨Ca2+-ATP酶的抑制作用并預(yù)測了相應(yīng)的靶標(biāo)位點，本研究初步明確了東莨菪內(nèi)酯對朱砂葉螨的殺螨作用機理，即東莨