核蛋白SET絲氨酸9位點模擬磷酸化對PP2A的抑制作用.pdf

1、背景：阿爾茨海默?。ˋlzheimers Disease，AD）是最常見的神經退行性疾病之一，神經原纖維纏結和老年斑是其主要的病理學特征性改變。核蛋白SET/I2PP2A是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP2A的內源性抑制劑，主要分布在細胞核中，在細胞質中分布很少；胞漿PP2A活性下調是阿爾茨海默?。ˋD）發(fā)病最為關鍵的原因也被認可，但SET自核轉運至胞漿的具體過程及其對PP2A活性影響的具體機制尚不清楚。
　　 方法：通過基因定點突變S

2、ET Ser-9為丙氨酸（相關位點不能被磷酸化）模擬SET的非磷酸化狀態(tài)（npSET），將Ser-9突變?yōu)楣劝彼幔ɡ闷銹O4基團的負電荷效應而更易磷酸化）模擬SET的磷酸化狀態(tài)（pSET），構建npSET和pSET兩個質粒。在細胞水平用Lipofectamine2000在HEK293/tau細胞轉染分別轉染pcDNA3.1，wtSET，npSET和pSET四個質粒.在轉染后24 h，48 h和72 h后，使用CCK-8檢測細胞活力；使

3、用絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶試劑盒測定PP2A活性；分別用westernblotting（WB）和免疫熒光技術檢測來檢測tau蛋白過度磷酸化的程度和分布情況；WB檢測一些相關細胞凋亡因子的表達情況。
　　 結果：
　　 （1）HEK293/tau細胞在轉染磷酸化SET 24 h后細胞活力明顯降低，相比轉染野生型SET在48 h后才出現(xiàn)細胞活力降低，非磷酸化的SET在轉染24 h，48 h和72 h都不會導致細胞活力降低；

4、>　　 （2）磷酸化SET相比野生型SET對PP2A活性有更明顯抑制作用，抑制強度大約是野生型SET的1.25倍，p值為0.006，非磷酸化SET相比pcDNA3.1對PP2A沒有任何抑制作用；
　　 （3）在轉染48h后，磷酸化SET對tau蛋白一些位點磷酸化作用非常明顯，包括：Ser199，Thr205，Ser214，Ser262，Ser396和Ser404，而非磷酸化SET卻不能促使tau蛋白上述位點的磷酸化；
　

5、　 （4）在轉染48 h后，磷酸化SET能上調bax/bcl-2比率，增強p53活性卻沒有導致細胞凋亡的發(fā)生。
　　 （5）過表達野生型，非磷酸化和磷酸化SET顯著上調GSK-3?活性。
　　 （6）非磷酸化和磷酸化SET可以修飾PP2Ac Tyr307位點，使其磷酸化增強。
　　 （7）野生型SET和磷酸化SET可以修飾PP2A Leu309位點，使其去甲基化。
　　 （8）過表達磷酸化SET可以上調