BaP誘導(dǎo)H2AX磷酸化及其對(duì)細(xì)胞核蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是廣泛存在于水、沉積物、土壤、植物和空氣環(huán)境中的污染物，主要來(lái)源于工業(yè)廢氣、汽車(chē)尾氣、油煙、吸煙、熏制食品等。PAHs是極其穩(wěn)定的，所以造成環(huán)境的持續(xù)污染。苯并芘(Benzo[a]pyrene，BaP)是典型的強(qiáng)致癌性的多環(huán)芳烴類化合物，對(duì)其已有許多深入的研究報(bào)道。BaP通過(guò)機(jī)體代謝產(chǎn)生的BPDE(benzo[a]pyrene-7，8-diol-9，10-

2、epoxide)是目前已知的最強(qiáng)的致癌物之一。BaP可阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與DNA形成加合物，導(dǎo)致DNA的斷裂，誘導(dǎo)p53基因突變等等。但是就BaP可否誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(doublestrandbreaks，DSBs)的標(biāo)記γH2AX(磷酸化的組蛋白H2AX)，報(bào)道不一。而且關(guān)于BaP誘導(dǎo)γH2AX產(chǎn)生的周期依賴性及參與形成γH2AX的激酶的研究也未見(jiàn)報(bào)道。 此外，以往的研究結(jié)果僅在單方面揭示BaP可能的遺

3、傳毒性或致癌的機(jī)理。然而B(niǎo)aP誘導(dǎo)的遺傳毒性與細(xì)胞應(yīng)答，可能的致癌機(jī)理并不是由單一或幾個(gè)基因造成的，癌變是多因素、多階段的過(guò)程。單純針對(duì)某一個(gè)基因開(kāi)展工作，很難發(fā)現(xiàn)與癌癥相關(guān)明確的機(jī)理。以基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為主的高通量掃描技術(shù)的出現(xiàn)為此研究提供了一種新的研究思路.通過(guò)分析一個(gè)生物過(guò)程中基因組或蛋白組的變化，可以全面地了解參與生物過(guò)程的相關(guān)基因，構(gòu)建細(xì)胞應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，解析關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而更深入地探討其潛在的分子機(jī)制。應(yīng)用此類技術(shù)，

4、已對(duì)BaP所誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行了分析，并鑒定了一批應(yīng)答基因和蛋白。但是作為一種主要以DNA為靶點(diǎn)的化合物，BaP誘導(dǎo)的DNA損傷，勢(shì)必引起DNA修復(fù)應(yīng)答，從而影響正常的基因表達(dá)，造成細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)差異。因?yàn)閰⑴cDNA損傷應(yīng)答的蛋白理論上都應(yīng)在細(xì)胞核內(nèi)，所以研究BaP對(duì)細(xì)胞核蛋白表達(dá)的影響可能會(huì)對(duì)理解其遺傳毒性及癌變的機(jī)制提供更有效的信息。 鑒于以上原因，本研究首先系統(tǒng)地探討了BaP處理細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞生存率和細(xì)胞周期的影響，及其

5、造成的DNA損傷是否可誘導(dǎo)γH2AX的產(chǎn)生。本論文的第一部分中，通過(guò)應(yīng)用HeLa細(xì)胞我們首先驗(yàn)證BaP是否可誘導(dǎo)H2AX的磷酸化。采用MTT法，檢測(cè)BaP對(duì)HeLa細(xì)胞生存率的影響；流式細(xì)胞技術(shù)分析了BaP對(duì)細(xì)胞周期的影響。采用了免疫熒光染色及Western-blot方法，研究了BaP誘導(dǎo)γH2AX的時(shí)間及濃度效應(yīng)及γH2AX產(chǎn)生與細(xì)胞周期的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用基因缺失的細(xì)胞系及激酶抑制劑，研究了參與BaP誘H2AX磷酸化的激酶

6、。 通過(guò)以上的研究發(fā)現(xiàn)，BaP只有在較高劑量和長(zhǎng)時(shí)間處理情況下對(duì)細(xì)胞活力有影響；對(duì)細(xì)胞周期影響較明顯，可使細(xì)胞滯留于S期。BaP在HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)γH2AX的產(chǎn)生，并具有顯著的時(shí)間及濃度效應(yīng)，且具有S期或G2/M期的依賴性。通過(guò)不同基因缺失細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，BaP同樣也可誘導(dǎo)γH2AX的產(chǎn)生，而且PIKKs(phosphatidylinositol3-kinase-likeproteinkinases)家族的主要成員，包括ATM

7、(ataxiatelangiectasiamutatedkinase)、ATR(ATMandRad3-relatedkinase)和DNA-PK(DNA-dependentproteinkinase)，在功能上互補(bǔ)或重疊參與了這一過(guò)程，本論文的第二部分主要應(yīng)用蛋白組學(xué)的方法系統(tǒng)分析了BaP對(duì)HeLa細(xì)胞核蛋白表達(dá)的影響。研究中我們使用10μmol.L-1的BaP處理HeLa細(xì)胞6h、12h、24h后，提取核蛋白，進(jìn)行Bradford定量

8、。樣本進(jìn)行雙向電泳分析，使用GS-800掃描儀獲取圖像，運(yùn)用PDQuest7.1軟件分析數(shù)字化圖像文件，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)；膠內(nèi)酶解后使用液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MSIMS)分析差異點(diǎn)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，BaP處理引起128個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)發(fā)生了顯著性的改變，對(duì)其中易切取的差異點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，最終鑒定了24種理論上符合的蛋白。進(jìn)一步對(duì)其中鑒定的LanunA和Bub3蛋白進(jìn)行了Western-blot，共聚焦顯微鏡(Co