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文檔簡介
1、多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)是廣泛存在于水、沉積物、土壤、植物和空氣環(huán)境中的污染物,主要來源于工業(yè)廢氣、汽車尾氣、油煙、吸煙、熏制食品等。PAHs是極其穩(wěn)定的,所以造成環(huán)境的持續(xù)污染。苯并芘(Benzo[a]pyrene,BaP)是典型的強致癌性的多環(huán)芳烴類化合物,對其已有許多深入的研究報道。BaP通過機體代謝產(chǎn)生的BPDE(benzo[a]pyrene-7,8-diol-9,10-
2、epoxide)是目前已知的最強的致癌物之一。BaP可阻斷細胞生長分化調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導,與DNA形成加合物,導致DNA的斷裂,誘導p53基因突變等等。但是就BaP可否誘導細胞產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(doublestrandbreaks,DSBs)的標記γH2AX(磷酸化的組蛋白H2AX),報道不一。而且關(guān)于BaP誘導γH2AX產(chǎn)生的周期依賴性及參與形成γH2AX的激酶的研究也未見報道。 此外,以往的研究結(jié)果僅在單方面揭示BaP可能的遺
3、傳毒性或致癌的機理。然而BaP誘導的遺傳毒性與細胞應答,可能的致癌機理并不是由單一或幾個基因造成的,癌變是多因素、多階段的過程。單純針對某一個基因開展工作,很難發(fā)現(xiàn)與癌癥相關(guān)明確的機理。以基因組學和蛋白質(zhì)組學為主的高通量掃描技術(shù)的出現(xiàn)為此研究提供了一種新的研究思路.通過分析一個生物過程中基因組或蛋白組的變化,可以全面地了解參與生物過程的相關(guān)基因,構(gòu)建細胞應答網(wǎng)絡,解析關(guān)鍵細胞信號轉(zhuǎn)導通路,從而更深入地探討其潛在的分子機制。應用此類技術(shù),
4、已對BaP所誘導的細胞應激反應進行了分析,并鑒定了一批應答基因和蛋白。但是作為一種主要以DNA為靶點的化合物,BaP誘導的DNA損傷,勢必引起DNA修復應答,從而影響正常的基因表達,造成細胞內(nèi)蛋白表達差異。因為參與DNA損傷應答的蛋白理論上都應在細胞核內(nèi),所以研究BaP對細胞核蛋白表達的影響可能會對理解其遺傳毒性及癌變的機制提供更有效的信息。 鑒于以上原因,本研究首先系統(tǒng)地探討了BaP處理細胞后對細胞生存率和細胞周期的影響,及其
5、造成的DNA損傷是否可誘導γH2AX的產(chǎn)生。本論文的第一部分中,通過應用HeLa細胞我們首先驗證BaP是否可誘導H2AX的磷酸化。采用MTT法,檢測BaP對HeLa細胞生存率的影響;流式細胞技術(shù)分析了BaP對細胞周期的影響。采用了免疫熒光染色及Western-blot方法,研究了BaP誘導γH2AX的時間及濃度效應及γH2AX產(chǎn)生與細胞周期的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,進一步使用基因缺失的細胞系及激酶抑制劑,研究了參與BaP誘H2AX磷酸化的激酶
6、。 通過以上的研究發(fā)現(xiàn),BaP只有在較高劑量和長時間處理情況下對細胞活力有影響;對細胞周期影響較明顯,可使細胞滯留于S期。BaP在HeLa細胞中誘導γH2AX的產(chǎn)生,并具有顯著的時間及濃度效應,且具有S期或G2/M期的依賴性。通過不同基因缺失細胞的研究發(fā)現(xiàn),BaP同樣也可誘導γH2AX的產(chǎn)生,而且PIKKs(phosphatidylinositol3-kinase-likeproteinkinases)家族的主要成員,包括ATM
7、(ataxiatelangiectasiamutatedkinase)、ATR(ATMandRad3-relatedkinase)和DNA-PK(DNA-dependentproteinkinase),在功能上互補或重疊參與了這一過程,本論文的第二部分主要應用蛋白組學的方法系統(tǒng)分析了BaP對HeLa細胞核蛋白表達的影響。研究中我們使用10μmol.L-1的BaP處理HeLa細胞6h、12h、24h后,提取核蛋白,進行Bradford定量
8、。樣本進行雙向電泳分析,使用GS-800掃描儀獲取圖像,運用PDQuest7.1軟件分析數(shù)字化圖像文件,發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白點;膠內(nèi)酶解后使用液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MSIMS)分析差異點。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,BaP處理引起128個蛋白點表達發(fā)生了顯著性的改變,對其中易切取的差異點進行了質(zhì)譜分析,最終鑒定了24種理論上符合的蛋白。進一步對其中鑒定的LanunA和Bub3蛋白進行了Western-blot,共聚焦顯微鏡(Co
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