高糖誘導HK-2細胞非磷酸化β-catenin表達及蟲草菌液對其作用.pdf

1、研究背景及目的:
　　糖尿病腎病(DN)是終末期腎病的主要原因之一，其腎間質病變與遠期預后密切相關。研究表明腎小管上皮細胞轉分化(EMT)參與腎間質纖維化進展。
　　β-catenin是一種多功能蛋白質，除了與E鈣粘蛋白(E-cad)連接介導細胞粘附外，還參與了多條EMT通路的信號轉導，該功能與其代謝過程有關:β-catenin在胞質中與多種蛋白共同組成Axin復合物，隨后被CK1、GSK3磷酸化，進而被泛素-蛋白酶系統(tǒng)降解

2、。β-catenin磷酸化與否決定了其是否被降解，非磷酸化β-catenin是其活化形式，不能被泛素-蛋白酶降解系統(tǒng)識別，因而在胞質內累積并轉移入核，與核內轉錄因子TCF/LEF結合，激活靶基因轉錄。研究表明β-catenin信號在糖尿病腎病EMT中是活化的，但既往研究多通過觀察β-catenin表達部位變化或蛋白總含量及胞核含量變化反映其是否活化，而直接對非磷酸化β-catenin（活化形式）研究較少，在糖尿病腎病中也未見報道。

3、>　　冬蟲夏草是我國名貴中藥材，廣泛用于腎臟疾病的治療，對糖尿病腎病有一定療效。近期研究表明其腎保護作用涉及抑制EMT，能改善高糖誘導的腎小管上皮細胞自身表型丟失、間質細胞表型增加，降低尿蛋白排泄、減少腎間質膠原沉積及減輕腎損傷，但具體機制尚不清楚。
　　本實驗將觀察高糖環(huán)境下人近端腎小管上皮細胞（HK-2）非磷酸化β-catenin表達，探討β-catenin活化與EMT的關系。同時采用蟲草菌液進行干預，觀察其對上述過程的影響，

4、探索其腎保護作用的可能新機制。
　　方法:
　　應用細胞培養(yǎng)技術，分下列六組培養(yǎng)HK-2細胞:正常對照組(5.5mM葡萄糖DMEM/F12培養(yǎng)液)，高糖組（30 mM葡萄糖DMEM/F12培養(yǎng)液），甘露醇組（5.5mM葡萄糖DMEM/F12培養(yǎng)液+甘露醇24.5 mM），高糖+5μg/mL蟲草菌液干預組（HG+C5組，5.5mM葡萄糖DMEM/F12培養(yǎng)液+5μg/mL蟲草菌液），高糖+10μg/mL蟲草菌液干預組(HG+C

5、10組，5.5mM葡萄糖DMEM/F12培養(yǎng)液+10μg/mL蟲草菌液)，高糖+20μg/mL蟲草菌液干預組（HG+C20組，5.5mM葡萄糖DMEM/F12培養(yǎng)液+20μg/mL蟲草菌液）。培養(yǎng)48h后收集各組細胞，Western Blot檢測E-cad、α-SMA、非磷酸化β-catenin的蛋白表達。
　　結果:
　　高糖組與正常組及甘露醇組比較，E-cad表達減少(P＜0.01)，α-SMA表達增加(P＜0.01)，

6、同時非磷酸化β-catenin表達增加(P＜0.01)。蟲草菌液干預后，與高糖組比較，HG+C5組E-cad表達無明顯變化(P＞0.05)，HG+C10、HG+C20組E-cad表達上調(P＜0.01)，蟲草菌液干預的三組α-SMA表達均下調(P＜0.01);蟲草菌液干預的三組非磷酸化β-catenin表達較高糖組均下調(P＜0.01)，且隨蟲草菌液濃度增大其下調幅度增大(P＜0.01)。
　　結論:
　　1、高糖環(huán)境下HK