過表達E-鈣黏蛋白對高糖誘導的HK-2細胞轉分化的影響.pdf

1、目的:E-鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad) cDNA質粒轉染高糖誘導的人腎小管上皮細胞(HK-2)，觀察E-cad的過表達對上皮細胞-間充質轉分化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)及細胞外基質表達的影響。
　　 方法:(1)采用大腸桿菌DH5α進行E-cad cDNA質粒及空白質粒擴增，酶切鑒定，測序驗證。(2)體外培養(yǎng)HK-2，將HK-2分為正常對照組、高糖組(30mmo

2、l/l)、甘露醇組（30mmo/l），倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學的變化;采用Real time PCR、Western Blot分別觀察0h、24h、48h、72h E-cad和α-SMA的RNA及蛋白表達;采用ElISA法檢測不同時間點培養(yǎng)液上清中COLⅠ、COLⅢ和FN的濃度變化，觀察高糖對HK-2 EMT及細胞外基質的影響。(3)將HK-2分為正常對照組、空質粒組、E質粒組，通過脂質體轉染E-cad質粒，采用Real timePC

3、R和Western Blot方法分別檢測0h、24h、48h、72h E-cad的表達水平。(4)將HK-2分為正常對照組、高糖組、E質粒組、E質粒+高糖組、空白質粒+高糖組。觀察48h E-cad過表達對HK-2 EMT的影響，采用Real time PCR、Western Blot分別觀察高糖刺激后48h E-cad和α-SMA的mRNA及蛋白表達;采用ElISA法檢測培養(yǎng)液上清中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和FN的濃度變化。
　　

4、 結果:(1)擴增質粒經限制性內切酶電泳鑒定，測序分析證實，擴增質粒序列無突變。(2)高糖作用后可見HK-2由橢圓形貼壁生長變?yōu)殚L梭形，以48h、72h尤為明顯;E-cad表達下調，α-SMA表達上調，與正常對照組與甘露醇組相比均有顯著性差異;ELISA結果顯示，高糖刺激后COLⅠ、COLⅢ和FN表達呈時間依賴性上調，其中48h、72h與正常對照組與甘露醇組相比有顯著性差異。(3)經E-cad質粒轉染后熒光顯微鏡下可見GEFP表達;R

5、eal time PCR和Western blot結果表明，E-cad mRNA及蛋白表達均上調，其中轉染后24h、48h、72h與正常對照組和空質粒轉染組相比，有顯著性差異。(4)高糖作用48h后，顯微鏡下觀察HK-2細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)E-cad轉染組細胞變形較高糖組減輕。Real time PCR和Western Blot結果顯示，較高糖組和空質粒轉染組差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);ELISA表明，過表達E-cad能明顯抑制高糖誘導