MicroRNA-373誘導(dǎo)E-鈣粘蛋白表達(dá)及其對肺癌A549細(xì)胞生長的影響.pdf

1、目的:人工構(gòu)建hsa-mir-373真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗和體內(nèi)裸鼠移植瘤實驗探討對腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘蛋白表達(dá)、腫瘤細(xì)胞周期及遷移粘附的影響。
　　方法:依據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫中hsa-mir-373序列，設(shè)計mir-373序列片段，設(shè)計時在序列內(nèi)加入相應(yīng)的酶切位點，以利于后期的鑒定。同時設(shè)計一對照序列，設(shè)計好的片段進(jìn)行Blast比對以確保與現(xiàn)有序列沒有同源性。片段合成后，經(jīng)過退火并形成雙鏈通過

2、連接酶插入pGenesil-1真核表達(dá)載體中。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法分別將重組mir-373質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染重組mir-373質(zhì)粒A549細(xì)胞和對照質(zhì)粒A549細(xì)胞采用G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)mir-373及對照序列的細(xì)胞系。熒光定量PCR檢測未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞、轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染重組mir-373A549細(xì)胞中mir-373的表達(dá)水平。RT-PCR、Weshern blo

3、t檢測各組細(xì)胞中E-鈣粘蛋白mRNA及蛋白的表達(dá);運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞中E-鈣粘蛋白表達(dá)和分布;采用MTT法檢測各組增殖能力;運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期;采用體外劃痕實驗檢測細(xì)胞的體外遷移能力。將未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞、轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染重組mir-373質(zhì)粒A549細(xì)胞分別接種于裸鼠背部皮下，觀察各組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤率、腫瘤生長速度及大小。30天后處死裸鼠，完整剝離腫瘤，稱量腫瘤重量。Western bl

4、ot及免疫組織化學(xué)檢測各組腫塊中E-鈣粘蛋白的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:酶切和測序表明設(shè)計的重組mir-373質(zhì)粒和對照序列質(zhì)粒構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞中發(fā)出熒光。經(jīng)G418篩選獲得了可以穩(wěn)定表達(dá)mir-373序列及對照序列的細(xì)胞系。熒光定量PCR結(jié)果證實，與未轉(zhuǎn)染空白細(xì)胞和轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了重組mir-373的細(xì)胞中mir-373的表達(dá)量增加。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組mir-373質(zhì)粒A549細(xì)胞增殖能力減

5、弱，細(xì)胞生長能力減低。各組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞周期變化沒有明顯的差異。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了重組mir-373質(zhì)粒的A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯增加（P＜0.01），半定量分析顯示E-cadherin蛋白的表達(dá)增加了大約40％。免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)增多，其分布遍布整個胞漿中。實驗組中經(jīng)過24小時后，空白組和對照組細(xì)胞劃痕基本愈

6、合，而實驗組劃痕依然明顯?？瞻捉M和對照組的裸鼠移植瘤生長較快，實驗組移植瘤生長速度明顯減慢，瘤體體積和重量顯著降低。轉(zhuǎn)染重組mir-373質(zhì)粒的A549細(xì)胞移植瘤組織標(biāo)本中E-cadherin的表達(dá)明顯增加。
　　結(jié)論:hsa-mir-373在體外實驗中可上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，并可以抑制肺癌A549細(xì)胞的遷移，但卻不影響腫瘤細(xì)胞周期的變化。重組mir-373質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長要能顯著抑制肺癌A549細(xì)胞在