間隙蛋白43和E-鈣粘蛋白在肺癌中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、背景和目的：
　　細(xì)胞間的間隙連接通訊在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面具有重要效應(yīng)，而上皮細(xì)胞間粘附連結(jié)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中，間隙連接蛋白(Connexin，Cx)在細(xì)胞間的間隙連接通訊上，E-鈣粘蛋白（E-cadherin/E-CD）在上皮細(xì)胞間粘附連結(jié)上發(fā)揮著重要作用。
　　Cx是一種構(gòu)成細(xì)胞間連接方式的蛋白，控制著特異細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、新陳代謝、增值和分化等，多種腫瘤間隙連接結(jié)構(gòu)或功能的改變與Cx表達(dá)相關(guān)，Cx基因表達(dá)對(duì)

2、大多數(shù)腫瘤的生長(zhǎng)起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，因此Cx被認(rèn)為是潛在的非突變型抑癌因子。
　　E-鈣粘蛋白是一種鈣依賴性細(xì)胞粘附分子，是上皮細(xì)胞的極性及細(xì)胞間粘附連結(jié)的主要分子，介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的粘附，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，E-鈣粘蛋白可以阻止腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)的病灶，E-鈣粘蛋白表達(dá)與上皮性腫瘤的侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此E-鈣粘蛋白被認(rèn)為是重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。
　　肺癌(Lungcancer)是原發(fā)性支氣管肺癌(Primarya

3、rybronchogeniccarcinoma)簡(jiǎn)稱，是一種常見(jiàn)的肺部惡性腫瘤，絕大多數(shù)起源于支氣管粘膜上皮，常有區(qū)域性淋巴轉(zhuǎn)移、血行播散和經(jīng)支氣管擴(kuò)散。可以推測(cè)Cx和E-鈣粘蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能起著一定作用，目前已有的研究尚不完善，缺乏這方面系統(tǒng)的臨床研究和基礎(chǔ)研究。為此，本研究分三個(gè)部分系統(tǒng)探索和分析肺癌發(fā)生發(fā)展中Cx43和E-鈣粘蛋白的作用和臨床意義。
　　第一部分間隙蛋白43在肺癌中的表達(dá)及臨床意義
　　方法：<

4、br>　　收集未接受過(guò)放化療以及病理證實(shí)為肺癌的手術(shù)組織標(biāo)本50例，對(duì)照取自癌旁組織3cm以上的正常肺組織。采用常規(guī)組織學(xué)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;采用免疫組織化學(xué)進(jìn)行Cx43蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);采用RT-PCR方法進(jìn)行Cx43mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);并與臨床資料進(jìn)行比分析。數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、50例病例中，根據(jù)按UICC標(biāo)準(zhǔn)判定TNMF分期:Ⅰ期12例，Ⅱ期1

5、5例，Ⅲ期19例，Ⅴ期4例;組織學(xué)分型:腺癌24例，鱗癌19例，大細(xì)胞未分化癌7例;病理分級(jí):高分化10例，中分化20例，低分化20例;其中伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例。
　　2、Cx43蛋白經(jīng)IHC檢測(cè)顯示，Cx43蛋白呈現(xiàn)棕黃色染色顆粒分布于細(xì)胞漿中為陽(yáng)性表達(dá)。在正常肺組織中的支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞均呈陽(yáng)性高表達(dá);隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展，Cx43蛋白表達(dá)逐漸降低，在Ⅲ，Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ，Ⅱ期;低分化的肺癌陽(yáng)性表達(dá)

6、率明顯低于中、高分化的肺癌，Cx43表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。Cx43在鱗癌和大細(xì)胞未分化癌陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于肺腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)。
　　3、正常肺組織、癌旁組織和中肺癌組織中Cx43mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為58.66±8.1、42.09±2.7和36.05±3.1，肺癌組織中Cx43mRNA相對(duì)表達(dá)量與正常肺組織、癌旁組織比較顯著降低，差異均有非常顯著性(P＜0.05)。Cx43mRNA也與患者的組織學(xué)類型、臨床分期和淋巴

7、結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　第二部分E-鈣粘蛋白在肺癌中的表達(dá)及臨床意義
　　方法：
　　收集未接受過(guò)放化療以及病理證實(shí)為肺癌的手術(shù)組織標(biāo)本50例，對(duì)照取自癌旁組織3cm以上的正常肺組織。采用常規(guī)HE染色進(jìn)行組織學(xué)形態(tài)學(xué)觀察;石蠟切片，利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)E-鈣粘蛋白表達(dá);提取mRNA，以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄cDNA，采用PCR方法檢測(cè)E-鈣粘蛋白mRNA表達(dá);并與臨床資料進(jìn)行比分析。數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進(jìn)

8、行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、E-鈣粘蛋白免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)顯示，在正常肺組織中的支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和癌旁組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)。Ⅰ～Ⅱ期肺癌組織中E-cadherin陽(yáng)性率59.26％，Ⅲ～Ⅴ期陽(yáng)性率為21.74％，差異有非常顯著性(P＜0.05)。高、中分化肺癌組織中E-cadherin陽(yáng)性率56.67％，低分化期陽(yáng)性率為20.00％，差異有非常顯著性(P＜0.05)。E-c

9、adherin陽(yáng)性表達(dá)與患者的組織學(xué)類型和臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2、正常肺組織、高、中分化肺鱗癌組織和低分化肺鱗癌組織中E-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為56.7±4.26、27.2±10.2和4.3±3.0，高、中分化肺鱗癌組織和低分化肺鱗癌組織中E-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量與正常肺組織比較均顯著降低，差異均有非常顯著性(P＜0.05)。E-cadherinmRNA也與患者的組織學(xué)類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相

10、關(guān)。
　　第三部分上調(diào)E-鈣粘蛋白基因表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549生物學(xué)行為的影響
　　方法：
　　以含有E-cadherin基因全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pUC57-E-cadherin為模板，PCR擴(kuò)增出E-cadherin基因;HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后重組入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，經(jīng)過(guò)序列分析鑒定得到E-cadherin重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-E-cadherin。使用BTX將pcDNA3.1(+)

11、-E-cadherin電轉(zhuǎn)入肺癌細(xì)胞A549，篩選培養(yǎng)得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。RT-PCR和Western-blot方法分別檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞E-cadherinmRNA和蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞增殖和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)E-cadherin對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)E-cadherin對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高表達(dá)E-cadherin對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1、得到246

12、6bp的目的基因E-cadherin擴(kuò)增片段，與預(yù)測(cè)一致。HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定得到E-cadherin重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-E-cadherin。
　　2、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-E-cadherin的E-cadherin組與兩個(gè)對(duì)照組細(xì)胞E-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量比較，均顯著升高，差異有非常顯著性(p＜0.01，F(xiàn)=757.74)，說(shuō)明構(gòu)建的重組E-cadherin載體(pcDN

13、A3.1(+)-E-cadherin)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，能高效表達(dá)E-cadherinmRNA。
　　3、pcDNA3.1(+)-E-cadherin的E-cadherin組與兩個(gè)對(duì)照組細(xì)胞E-cadherin免疫印跡條帶光密度比較顯著升高，差異有非常顯著性(p＜0.01)。與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。
　　4、E-cadherin組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-E-cadherin的A549細(xì)胞）細(xì)胞的吸光度值與二個(gè)對(duì)照

14、組比較，在2d、3d、4d、5d均顯示降低，差異有顯著性(p＜0.05)
　　5、E-cadherin組與二個(gè)對(duì)照組（表達(dá)載體對(duì)照組和空白對(duì)照組）比較，軟瓊脂集落形成數(shù)顯著減少，差異有非常顯著性(P＜0.01)。
　　6、空白對(duì)照組與表達(dá)載體對(duì)照組細(xì)胞劃痕修復(fù)速度一致，二者與E-cadherin組細(xì)胞劃痕修復(fù)速度比均顯示修復(fù)較快。
　　7、E-cadherin組與二個(gè)對(duì)照組（表達(dá)載體對(duì)照組和空白對(duì)照組）比較，穿透Mat

15、rigel的平均細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有非常顯著性(P＜0.01)。
　　8、空白對(duì)照組、表達(dá)載體對(duì)照組和E-cadherin組凋亡率比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、在正常肺組織中的支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞Cx43基因均呈陽(yáng)性高表達(dá);隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展，Cx43蛋白表達(dá)逐漸降低，在Ⅲ，Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ，Ⅱ期;低分化的肺癌陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于中、高分化的肺癌，Cx43表達(dá)與

16、肺癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性。
　　2、E-cadherin基因在正常肺組織中的支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和癌旁組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)。隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展，E-cadherin表達(dá)逐漸降低，在Ⅲ，Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ，Ⅱ期;低分化的肺癌陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于中、高分化的肺癌，E-cadherin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　3、構(gòu)建E-cadherin重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-E-cadherin，并得到