鉛致人腎小管上皮細(xì)胞HK-2凋亡、轉(zhuǎn)分化研究以及鉛結(jié)合蛋白分離鑒定.pdf

1、由于環(huán)境鉛污染的普遍性和腎臟對(duì)鉛毒作用的敏感性，目前鉛性腎病的危害在國(guó)際、國(guó)內(nèi)都是較普遍的。鉛對(duì)腎臟的毒性作用是一個(gè)隱匿而漸進(jìn)的過(guò)程，早期是亞臨床型的，可逆的，發(fā)展到一定階段即不可逆轉(zhuǎn)。研究資料顯示鉛對(duì)腎臟的毒作用部位主要在腎近曲小管。鉛性腎病病理學(xué)改變?cè)缙谥饕谀I小管上皮細(xì)胞內(nèi)形成包涵體、損傷腎小管上皮細(xì)胞，繼而逐步出現(xiàn)腎小管萎縮、腎單位丟失、腎間質(zhì)纖維化導(dǎo)致腎功能低下。但目前對(duì)鉛的腎臟主要靶細(xì)胞-腎小管上皮細(xì)胞損傷的細(xì)胞機(jī)制、分子機(jī)

2、制知之甚少。本課題首先以正常人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)為研究對(duì)象，觀(guān)察醋酸鉛致HK-2細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化作用，其劑量反應(yīng)關(guān)系，以及對(duì)細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化信號(hào)通路相關(guān)分子的影響和碘化鉀的干預(yù)作用。 在此基礎(chǔ)上，本課題運(yùn)用功能蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分離鑒定與鉛有高親和性的結(jié)合蛋白，探討鉛致HK-2細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化的內(nèi)在原因。以往的研究顯示，鉛可在細(xì)胞內(nèi)與蛋白質(zhì)形成高親和性的鉛結(jié)合蛋白(PbBPs)，PbBPs的形成與鉛在腎臟引起的一種特征性

3、病理改變-腎小管上皮細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)形成包涵體有關(guān)。研究提示，鉛穿過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)沉積、遷移以及發(fā)揮其毒作用，是以鉛結(jié)合蛋白結(jié)合的形式來(lái)進(jìn)行的。所謂鉛結(jié)合蛋白是指與鉛有高親和結(jié)合能力，與細(xì)胞對(duì)鉛的適應(yīng)性、反應(yīng)性相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)鉛受體和靶點(diǎn)蛋白質(zhì)。鉛刺激HK-2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、轉(zhuǎn)分化時(shí)，是否有PbBPs參與其中？起了什么作用？在腎小管上皮細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型上分離鑒定PbBPs，將可能弄清楚鉛致細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化的真正原因所在，明了細(xì)胞內(nèi)的

4、分子靶點(diǎn)。并有可能找到新的高親和性的PbBPs，為開(kāi)發(fā)鉛蛋白質(zhì)絡(luò)合劑藥物提供證據(jù)。本課題以出現(xiàn)明顯凋亡、轉(zhuǎn)分化的HK-2細(xì)胞為研究對(duì)象，采用鉛親和柱一金屬螯合親和層析、一維SDS-PAGE電泳分離、ESI-MS/MS液-質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定混合蛋白質(zhì)樣品，免疫印跡法驗(yàn)證，這種功能蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選與HK-2細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化相關(guān)的鉛結(jié)合蛋白，用生物信息學(xué)方法分析鉛結(jié)合蛋白在鉛致HK-2細(xì)胞毒效應(yīng)中的可能作用。 本研究首次在體外觀(guān)察到

5、醋酸鉛具有刺激人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用；發(fā)現(xiàn)6個(gè)與鉛高親和性結(jié)合蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能分析顯示6個(gè)鉛結(jié)合蛋白與鉛致HK-2細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化有關(guān)；建立了一條新的高通量分離鑒定鉛結(jié)合蛋白的技術(shù)路線(xiàn)。 本課題共分三章進(jìn)行研究： 第一章不同劑量醋酸鉛致人腎小管上皮細(xì)胞凋亡及碘化鉀的拮抗作用 目的：研究醋酸鉛對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡劑量-反應(yīng)關(guān)系及碘化鉀的拮抗作用；醋酸鉛對(duì)NF-kB、bc

6、l-2蛋白質(zhì)表達(dá)的影響及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 方法：體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞分為不同劑量染鉛組：分別加入濃度為0、2.5、5、10、20、40μmol/L的醋酸鉛；碘化鉀干預(yù)組：加入終濃度為40mg/L的KI、37℃孵育30分鐘后加入上述不同劑量的醋酸鉛。染毒72h后分別用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定各組細(xì)胞的存活率；用相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)改變；Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡以及Hoechst33258染色法、熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)

7、胞凋亡形態(tài)；用間接免疫熒光-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NF-KB、bcl-2蛋白表達(dá)改變。 結(jié)果：(1)使HK-2細(xì)胞存活率明顯下降的醋酸鉛最低濃度是10μmol/L，醋酸鉛濃度越高.細(xì)胞存活率越低，存在劑量.反應(yīng)關(guān)系(r=-0.878，p<0.01)。(2)醋酸鉛作用72h，HK-2細(xì)胞LC50為15.68μmol/L;(3)從5μmol/L鉛劑量組開(kāi)始細(xì)胞形態(tài)有明顯改變，HK-2細(xì)胞由正常的立方形、多角形向長(zhǎng)梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)變，高濃度鉛組有大

8、量細(xì)胞變小、變園，直至細(xì)胞脫壁漂??；(4)2.5μmol/L醋酸鉛即可引起HK-2細(xì)胞凋亡率明顯增加(p<0.05)，細(xì)胞凋亡率在10μmol/L鉛濃度達(dá)到高峰值，鉛濃度再增加，細(xì)胞凋亡率不再相應(yīng)增加。(5) Hoechst33258染色，5μmol/L鉛組細(xì)胞核染色加深呈高亮藍(lán)色、模糊、核明顯固縮。10μmol/L鉛組大量細(xì)胞核濃染、固縮、核碎裂。(6)HK-2細(xì)胞NF-KB、bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度有隨著染鉛劑量增加而降低的趨勢(shì)，NF

9、-kB與Bcl-2降低顯著相關(guān)(r=0.71，p<0.01)。(7)細(xì)胞凋亡率與NF-kB、Bcl-2蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.625，p<0.01與r=-0.709，p<0.01)。(8)各劑量鉛組加40mg/L的KI，可使細(xì)胞存活率增加，LC50上升了3.33倍，細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞形態(tài)改變明顯改善。 結(jié)論：(1)醋酸鉛對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性存在明顯劑量反應(yīng)關(guān)系，低劑量醋酸鉛(2.5μmol/L)即可引起細(xì)胞凋亡明顯增加

10、，細(xì)胞形態(tài)改變，高濃度(10μmol/L)出現(xiàn)細(xì)胞大量壞死；醋酸鉛對(duì)HK-2細(xì)胞的LCso為15.68μmol/L。(2)醋酸鉛能下調(diào)HK-2細(xì)胞NF-KB、Bcl-2基因的表達(dá)，這可能是其誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的途徑之一。(3)40mg/L的KI可部分拮抗鉛對(duì)人腎小管細(xì)胞HK-2的損傷作用。 第二章醋酸鉛與碘化鉀對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化以及致纖維化標(biāo)志基因表達(dá)影響 目的：探討醋酸鉛是否可以誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及

11、其可能機(jī)制以及碘化鉀的影響。 方法：體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞系( HK-2)細(xì)胞分為不同劑量染鉛組：分別加入濃度為2.5、5、10μmol/L的醋酸鉛，以10.0μmol/L醋酸鉛組作為對(duì)照；碘化鉀干預(yù)組：加入終濃度為40mg/L的KI、37℃孵育30分鐘后加入上述不同劑量的醋酸鉛。染毒72h后應(yīng)用相差顯微鏡、間接免疫熒光，流式細(xì)胞術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀(guān)察HK-2細(xì)胞形態(tài)、a-SMA和FN蛋白表達(dá)的改變，

12、以及對(duì)致纖維化因子TGF-β1、CTGF的影響。 結(jié)果：(1)對(duì)照組正常人腎小管上皮細(xì)胞為近似方形或卵圓形，呈鵝卵石樣排列，細(xì)胞間緊密銜接，融合成單層。5μmol/l鉛組可見(jiàn)部分細(xì)胞形狀變長(zhǎng)、呈梭形，細(xì)胞間分離生長(zhǎng)。10μmol/l鉛組，除如上5μmol/l鉛組改變以外，尚有部分細(xì)胞邊界欠清晰、少數(shù)細(xì)胞變小、變園。(2)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記a-SMA陽(yáng)性細(xì)胞百分率在5、10μmol/L鉛組分別為9.32％、6.98％，與對(duì)照組比較明顯

13、增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。(3)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)標(biāo)志蛋白FN隨著醋酸鉛劑量的增加而增加，在5、10μmol/L組較對(duì)照組升高8.3、8.4倍，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(4)與對(duì)照組比較，5、10μmol/L醋酸鉛組TGF-βlmRNA以及蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(5)2.5、5、10μmol/L醋酸鉛組CTGFmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

14、0.05或P0.01)。(5)相同劑量醋酸鉛組加40mg/L的KI孵育，能在一定程度上抑制上述改變。 結(jié)論：(1)醋酸鉛可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，其作用機(jī)制可能與TGF-β1、CTGF表達(dá)調(diào)高有關(guān)。(2)40mg/l碘化鉀可以部分抑制鉛誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化以及TGF-β1、CTGF表達(dá)。 第三章人腎小管上皮細(xì)胞HK-2鉛結(jié)合蛋白分離鑒定 目的：篩選染鉛人腎小管上皮細(xì)胞鉛結(jié)合蛋白；分析鉛結(jié)合蛋白在鉛誘導(dǎo)H

15、K-2細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的可能作用；探索一條新的高通量分離鑒定鉛結(jié)合蛋白的技術(shù)路線(xiàn)。 方法：(1)人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)細(xì)胞分為5μmol/L染鉛組、對(duì)照組，醋酸鉛作用72h收獲細(xì)胞。(2)用非變性裂解液裂解細(xì)胞獲得水溶性蛋白質(zhì)樣品，用3kDa超濾管脫鹽和去除EDTA。(3)制備鉛親和柱( Pb-NTA)。(4)用鉛親和柱.金屬螯合親和層析分離與鉛有高親和性的蛋白質(zhì)。(5)1D-SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)。(6)

16、蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解。(7)混合蛋白質(zhì)肽段經(jīng)ESI-Q-TOF鑒定，輸出pkl文件。(8)將儀器輸出的pkl文件輸入數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBInr)，使用Mascot軟件中的串級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能進(jìn)行搜索。(9)對(duì)獲得鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(10)對(duì)質(zhì)譜鑒定出來(lái)的其中2個(gè)蛋白質(zhì)HSP90、TRAP-1進(jìn)行Westem-bloting分析驗(yàn)證。 結(jié)論：(1)在凋亡、轉(zhuǎn)分化HK-2細(xì)胞模型中篩選出6個(gè)鉛結(jié)合蛋白；(2)鉛誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡