碘化鉀與鉛對近曲腎小管上皮細胞HK-2中信號傳導通路及細胞凋亡的影響.pdf

1、我國歷年職業(yè)性鉛中毒位居慢性職業(yè)中毒的首位(血鉛診斷值為500μg/L)，而腎臟是僅次于大腦的第二個鉛靶器官，鉛性腎病危害隱匿，很難及早發(fā)現(xiàn)。鉛性腎病發(fā)病機理尚不完全清楚。國外對鉛在神經(jīng)系統(tǒng)的損害機制研究發(fā)現(xiàn)：神經(jīng)系統(tǒng)鉛損害可能與通過使細胞中相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導過程失控所造成長時程電位(long tenn portentiationLTP)紊亂有關(guān)，如：絲氨酸／蘇氨酸激酶通路等。因此，有理由懷疑通過信號通路的變化介導也可能是鉛致腎臟損害的機制

2、之一。以此為契入點有可能抓住鉛性腎病發(fā)病機理的主要環(huán)節(jié)，從分子水平詮釋慢性鉛性腎病的發(fā)病機制，并為其早期診斷、防治和鉛對其他器官的損傷機制提供新思路和理論依據(jù)。本課題以人近曲腎小管上皮細胞株HK-2為對象，研究了在該細胞株中鉛對鈣離子、蛋白激酶C和NFκB／IκB／IKKβ介導的信號傳導通路及其下游細胞凋亡調(diào)控基因bc1-2、bax和XIAP的影響，以及碘化鉀的拮抗作用機制。試圖從這個角度闡釋鉛性腎病的發(fā)病機制，并為鉛性腎病的防治提供新

3、的思路。全文分三個部分。 第一部分碘化鉀與鉛對人近曲腎小管上皮HK-2細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)影響 目的：研究鉛對人近曲腎小管上皮細胞HK-2中鈣離子穩(wěn)態(tài)的影 響及碘化鉀的保護機制。 方法：將培養(yǎng)的人近曲腎小管上皮細胞HK-2分為(1)空白對照組，(2)10umol／L的醋酸鉛組，(3)20umol/L的醋酸鉛組，(4)50umol／L的醋酸鉛組，(5)10umol／L的醋酸鉛+KI組，(6)20umol/L 的醋酸

4、鉛+KI組，(7)50umol／L的醋酸鉛+KI組共七組。應(yīng)用巢式PCR檢測人近曲腎小管上皮細胞HK-2中L-型電壓依賴性鈣離子通道(L-type calcium channl alpha CACNAlC)的表達。以Fluo-3／AM負染，激光共聚焦掃描顯微鏡檢測鉛和碘化鉀對人近曲腎小管上皮細胞HK-2中(1)鈣離子濃度的影響，(2)VDCC介導的鈣內(nèi)流的影響，(3)SOCC介導的鈣內(nèi)流的影響。 結(jié)果：(1)人近曲腎小管上皮細胞

5、HK-2中能檢測到CACNAlC mRNA表達。(2)鉛能夠降低人近曲腎小管上皮細胞HK-2中的鈣離子濃度，10umol／L的醋酸鉛組、20umol／L的醋酸鉛組、50umol／L的醋酸鉛組均p<0.01，碘化鉀能有效的抑制這種改變，在染鉛濃度較低的試驗組中經(jīng)碘化鉀孵育后，鈣離子濃度與對照組比較無顯著性差異；(3)鉛放大VDCC和SOCC介導鈣內(nèi)流的起始鈣電流。碘化鉀孵育后可糾正； 結(jié)論：(1)人類腎小管上皮細胞存在VDCC和S

6、OCC鈣通道；(2)鉛通過競爭鈣通道的特異性位點進入腎小管上皮細胞，在細胞外阻斷鈣內(nèi)流，在細胞內(nèi)下調(diào)鈣通道蛋白表達，擾亂鈣通道功能，造成細胞內(nèi)鈣濃度降低，穩(wěn)態(tài)失衡并直接損傷細胞器而損傷細胞；(3)碘化鉀絡(luò)合鉛，恢復Na<'+>-k<'+>-ATP酶活性，抑制鉛對鈣通道的競爭性結(jié)合，在細胞內(nèi)可抑制鉛對細胞器的損害。 第二部分碘化鉀與鉛對人近曲腎小管上皮HK-2細胞 內(nèi)PKCα、IKKβ、NF κB mRNA和蛋白表達的影響目的：

7、研究碘化鉀與鉛對人近曲腎小管上皮HK-2細胞內(nèi)PKCα、IKKβ、NFκBmRNA和蛋白表達的影響。方法：實驗分組同第一部分。應(yīng)用實時定量熒光PCR檢測PKCα、IKKβ、NFκB mRNA的表達，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測：PKCα、IKKβ、NFκB蛋白的表達。結(jié)果：(1)染鉛后PKCα、IKKβ、NFκB mRNA表達呈下調(diào)趨勢(50umol／L的醋酸鉛組均p<0.05)，且隨染鉛濃度的增高而下降，碘化鉀能夠抑制這種變化；(2)染鉛后PK

8、Cα、IKKβ、NFκB蛋白表達呈下調(diào)趨勢(50umol/L的醋酸鉛組均p<0.05)且隨染鉛濃度的增高而下降，碘化鉀能夠抑制這種變化，其變化與mRNA的變化平行。PKCα、NFκB表達具有相關(guān)性，提示兩者除了功能上相互作用之外，還能反饋調(diào)節(jié)對方的表達。結(jié)論：鉛下調(diào)人近曲腎小管上皮HK-2細胞中PKCα、IKKβ、NFκB的表達，近而使該通路調(diào)節(jié)的下游基因如細胞增殖基因、凋亡相關(guān)基因、炎癥因子基因等異常表達，可能是鉛介導腎臟損害的機制之

9、一。碘化鉀能在一定程度上抑制上述變化。 第三部分碘化鉀與鉛對人近曲腎小管上皮HK-2細胞內(nèi)bcl-2、bax、XlAP蛋白表達和細胞凋亡的影響目的：研究碘化鉀與鉛對人近曲腎小管上皮HK-2細胞內(nèi)bcl-2、bax、XIAP蛋白表達和凋亡的影響。方法：實驗分組同部分一。應(yīng)用 細胞組化法、流式細胞術(shù)檢測人近曲腎小管上皮KH-2細胞內(nèi)bcl-2、bax、XIAP蛋白表達；應(yīng)用FITC-Annexin V和PI雙染法檢測人近曲腎

10、小管上皮HK-2細胞凋亡。結(jié)果：(1)細胞組化檢測顯示人近曲腎小管上皮卸HK-2細胞bcl-2、bax、XIAP表達呈陽性； (2)流式細胞術(shù)定 量檢測顯示：染鉛后bcl-2蛋白表達下調(diào)(50umol／L的醋酸鉛組p<0．05)，且隨染鉛濃度升高而呈下降趨勢；XIAP變化與bcl-2相似(50umol／L的醋酸鉛組／P<0．05)；染鉛后bax蛋白表達增高(50umol／L的醋酸鉛組p<0.05)，且隨染鉛濃度的增高呈升