MMP-9-TIMP-1在高糖環(huán)境HK-2中的表達(dá)和意義及大黃酸對(duì)其影響.pdf

1、背景與目的: 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是引起終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的重要病因之一。在DN進(jìn)展為ESRD的過程中，腎小管間質(zhì)纖維化是其重要病理基礎(chǔ)。而細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix protein，ECM)過度堆積是。腎問質(zhì)纖維化的核心。腎間質(zhì)ECM主要由肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MyoF)分泌。在病理?xiàng)l件

2、下，腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生上皮細(xì)胞—肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation，EMT)是腎間質(zhì)MyoF的重要來源。EMT過程主要包括四個(gè)步驟：1)小管上皮細(xì)胞失去上皮粘附特性；2)小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA、重排肌動(dòng)蛋白；3)裂解小管基底膜；4)增強(qiáng)細(xì)胞移動(dòng)性和侵襲性。筆者所在實(shí)驗(yàn)組中，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明在DN進(jìn)程中，腎間質(zhì)ECM堆積增多，并且證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞

3、存在EMT，在DN的EMT中如何裂解小管基底膜? 在腎間質(zhì)中，Ⅳ型膠是維持腎小管基底膜完整性的主要成分，其降解酶為金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的重要一員，后者是主要的ECM降解酶系，與其抑制物TIMPs(tissue inhibitor of metallopro-teinases，T

4、IMPs)以1:1的分子比例存在于正常機(jī)體中，共同調(diào)節(jié)ECM，二者的比值在腎間質(zhì)病變的研究中比分別觀察二者更有意義，更能綜合反映系統(tǒng)降解ECM的能。MMP-9的特異性抑制物為TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種腎臟疾病中均觀察到MMP-9水平的增高和活性增強(qiáng)，MMP-9/TIMP-1比例失調(diào)。高糖環(huán)境下，人近段腎小管上皮細(xì)胞(human prox

5、imal tubular epithelial cells，HK-2)中是否存在EMT?HK-2細(xì)胞中MMP-9與TIMP-1的表達(dá)水平及二者之間的比值如何變化? 在DN的治療中，大黃是使用普遍的一味中藥。大黃酸(Rhein)是大黃的主要有效成分。臨床與實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均表明大黃酸具有肯定的腎臟保護(hù)作用。大黃酸對(duì)于腎臟的保護(hù)是否涉及到對(duì)于MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平及其比值的影響? 本研究擬于體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，觀察在HK

6、-2細(xì)胞中反映上皮細(xì)胞表型特征的E鈣黏蛋白(E-Cadherin)、反映MyoF表型特征的α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)及MMP-9/TIMP-1比值的變化，并用大黃酸干預(yù)處理，觀察大黃酸對(duì)上述指標(biāo)的影響，探討在DN病變中MMP-9、TIMP-1表達(dá)變化的意義，探討大黃酸延緩腎間質(zhì)病變的機(jī)制。 方法: 應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，按下列實(shí)驗(yàn)條件分組培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，分為以下六組：空白對(duì)照，即低糖(5

7、.5mmol/L)DMEM培養(yǎng)基；高滲對(duì)照組，高滲(甘露醇24.5mmol/L+5.5mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液)培養(yǎng)基；高糖(30mmol/L)DMEM培養(yǎng)基；高糖+大黃酸25μg/ml高糖+大黃酸50μg/ml；高糖+大黃酸100μg/ml。于48h收集各組細(xì)胞提取總蛋白，免疫印跡方法(Western Blotting，WB)檢測(cè)α-SMA、E-Cadherin的表達(dá)；分別于Oh、24h、48h、72h收集各組細(xì)胞提取總蛋白，

8、Western Blotting檢測(cè)MMP-9、TIMP-1的蛋白表達(dá)，并觀察MMP-9/TIMP-1比值變化。 結(jié)果: 高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞與低糖培養(yǎng)組比較，E-Cadherin表達(dá)下降(P<0.05)，α-SMA表達(dá)增高(P<0.05)，MMP-9的表達(dá)增高(P<0.05)，TIMP-1的表達(dá)增高(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值下降(P<0.05)。經(jīng)大黃酸處理后的各高糖環(huán)境培養(yǎng)組與無干預(yù)高糖培養(yǎng)組比

9、較，E-Cadherin表達(dá)增高(P<0.05)，α-SMA表達(dá)下降(P<0.05)，MMP-9表達(dá)下降(P<0.05)，TIMP-1表達(dá)下降(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值增高(P<0.05)，且MMP-9、TIMP-1的下調(diào)及其比值的上調(diào)隨藥物濃度與時(shí)間推移而更加明顯；與低糖培養(yǎng)組相比，α-SMA表達(dá)增高(P<0.05)，E-Cadherin表達(dá)下降(P<0.05)，MMP-9表達(dá)增高(P<0.05)，TIMP-1表達(dá)

10、增高(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值下降(P<0.05)。 結(jié)論: 1.高糖環(huán)境下，HK-2細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)增高，表明在高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞存在EMT； 2.高糖環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞MMP-9和TIMP-1的表達(dá)增高，MMP-9/TIMP-1下降，可能是加速腎臟病變的因素； 3.大黃酸可上調(diào)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞中E-Cadherin、下調(diào)α-SMA，阻抑