HL-60細胞ATRA誘導后MMP-9-TIMP-1及VEGF表達變化及意義的研究.pdf

1、急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)約占非淋巴系白血病的8％～15％，傳統(tǒng)治療以化療為主，并且是誘導緩解的有效方案。但化療，尤其是大劑量化療，可以增加感染或DIC等并發(fā)癥，往往引起早期死亡。而緩解后多次化療誘發(fā)的耐藥性，成為復發(fā)的主要原因之一，使得患者難以獲得再次緩解。因此，需要發(fā)掘新的更加有效和安全的藥物。在體外全反式維甲酸(all-transretinoicacidATRA)誘導HL-

2、60，U937和原代APL細胞發(fā)生終末分化的實驗結果基礎上，我國學者于1986年首次用ATRA治療APL并獲得成功，成為腫瘤誘導分化治療模式最為有效的范例，并由此被國際上稱之為白血病治療史上的一場“中國革命”。 ATRA治療APL的基本特點在于不殺傷腫瘤細胞，而是通過誘導惡性細胞向成熟階段分化，因而對機體正常組織損傷小，療效高，完全緩解率(CR)在80％～90％，并發(fā)癥少，無骨髓抑制，一般不誘發(fā)DIC。經(jīng)推廣應用后，其良好療效已

3、被國內(nèi)外學者所公認。ATRA現(xiàn)已列為APL誘導緩解治療的首選藥物。 雖然ATRA通過誘導白血病細胞分化而使患者達到CR。但是患者在用ATRA期間，亦較易出現(xiàn)一些常見的并發(fā)癥，約有25％的患者用ATRA治療后出現(xiàn)維甲酸綜合征，其癥狀表現(xiàn)為不明原因發(fā)熱、體重增加、呼吸困難、肺間質(zhì)浸潤等。此類癥狀與應用ATRA后出現(xiàn)的高白細胞征有關。 近幾年內(nèi)，研究者們認為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在血液系統(tǒng)疾病如白血病的發(fā)生中起了重要的作用

4、，當不成熟細胞從骨髓向外周血釋放的過程中，MMPs尤其起了很重要的作用。部分研究結果表明：髓系細胞分化時MMP-9分泌增加，而人外周血中的正常淋巴細胞進入外周組織時也伴有MMP-9分泌增加，推測與骨髓細胞成熟釋放有關。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)26種，它們是鋅離子依賴的蛋白酶，能夠降解多種細胞外基質(zhì)(ECM)成分。對腫瘤的發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移有非常重要的作用。組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是M

5、MPs的天然抑制物，是一組能抑制MMPs活性的多功能因子，目前已在人體中發(fā)現(xiàn)4種TIMPs。MMPs與TIMPs之間的平衡關系在調(diào)節(jié)(細胞外基質(zhì)(ECM)的穩(wěn)定中有重要作用，它們參與了人體內(nèi)許多生理與病理過程。由于能夠降解ECM，MMPs與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及發(fā)展有密切的關系，幾乎在所有的人類及動物腫瘤中MMPs表達均增加。MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用為：(1)破壞局部組織結構，促進腫瘤生長;(2)破壞基底膜屏障，利于腫瘤轉(zhuǎn)移;(3)通過對

6、細胞外基質(zhì)的改建，促進腫瘤新生血管形成。為了進一步探討誘導成熟后粒細胞釋放增加是否與MMP-9/TIMP-1變化有關，該研究選擇急性早幼粒細胞株HL-60細胞進行體外ATRA誘導分化，觀察MMP-9/TIMP-1與MMP-2的表達變化。 惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤新生血管形成有直接的關系。血管新生在腫瘤的生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。正常情況下，機體內(nèi)促血管新生因子與血管新生抑制因子處于一平衡狀態(tài)，當發(fā)生腫瘤性增殖時，促

7、血管新生因子的分泌增加，導致血管內(nèi)皮細胞增殖，新生血管形成，為不斷增殖的腫瘤細胞提供氧氣及營養(yǎng)成分。在目前已知的促血管生成因子中，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)是作用最強、特異性最高的一種因子，在腫瘤血管形成中起著重要作用。以往的研究主要集中于實體瘤，但最近的研究發(fā)現(xiàn)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤如白血病、多發(fā)性骨髓瘤患者中也存在著血管新生現(xiàn)象。因此，對血液系統(tǒng)惡性腫瘤血管新生的研究，將有助于對其發(fā)病機制的進一步了解及將抗血管生成療法用于臨床治療

8、惡性血液系統(tǒng)疾病，從而進一步提高其臨床療效，具有重要的意義。鑒于此，該項研究擬采用ATRA誘導人白血病細胞株HL-60細胞分化后，除檢測MMP-9/TIMP-1及MMP-2的表達變化，同時檢測VEGF及與其相關的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達變化，并探討其中的意義。 近年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因p53突變與VEGF的表達密切相關。p53是至今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關性最高的基因，是當前腫瘤分子生物學研究的熱點。人類惡性腫瘤中至少有50％發(fā)現(xiàn)了p53基

9、因的改變。野生型p53基因與細胞周期生長的調(diào)節(jié)、細胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)、DNA復制以及誘導細胞凋亡有密切關系。野生型p53的抗腫瘤作用主要是阻滯G1/G0期使細胞不能進入S期，從而抑制細胞增殖。另外，野生型p53基因可通過增強癌細胞對某些DNA損傷制劑敏感性達到抗腫瘤目的，也可通過Bcl-2家族作用調(diào)控細胞凋亡?？傊?，很多重要的與細胞周期以及細胞凋亡相關的基因都被p53調(diào)控，p53基因作為一個重要的腫瘤抑制基因，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中都具有重要作用

10、。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多惡性腫瘤中p53基因突變和VEGF的表達密切相關。p53基因可以調(diào)節(jié)細胞增殖活性及VEGF的表達，直接或間接影響腫瘤血管的生成。野生型p53(wtp53)能促進體外培養(yǎng)細胞血管形成抑制因子TSPmRNA的表達，而突變型p53(mtp53)能下調(diào)TSPmRNA的表達，同時促進VEGFmRNA的表達。關于VEGF與p53基因表達的相關性在胃癌、肺腺癌等實體瘤中均有報道，但在APL白血病細胞中二者表達的相關性卻鮮有報

11、道。該項工作就此作了初步探討。 低氧誘導因子(HIF-1α)是迄今為止發(fā)現(xiàn)唯一的特異性低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用機制正得到系統(tǒng)而深入研究。低氧誘導因子1α(HIF-1α)廣泛參與低氧誘導的適應性反應，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和HIF-1α具有密切關系，兩者均是由低氧誘導產(chǎn)生，在許多種組織細胞中廣泛表達，促進局部組織對低氧的耐受及新生血管形成。HIF-1α調(diào)控的多種基因和蛋白均以不同方式參與

12、腫瘤細胞對低氧的適應過程，從而增強了腫瘤細胞低氧環(huán)境下的生存能力，促進腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化。HIF-1α在多種實體腫瘤中均有表達，與腫瘤的惡性進展有直接的關系。它在腫瘤進展中的功能有：(1)促進糖酵解;(2)促進新生血管生成;(3)可能還參與了誘導細胞凋亡的過程。(4)其它：除此外，HIF-1α還可誘導各種促紅細胞生成因子(轉(zhuǎn)鐵蛋白)、擴血管因子等的表達來增加組織氧的運輸和利用能力。研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以誘導炎癥反應前急性期蛋白如血

13、漿銅藍蛋白的表達，因此HIF-1α可能還參與了應急反應。有關HIF-1α的研究已成為相關領域的熱點。 VEGF促進新生血管形成，為白血病細胞提供養(yǎng)分，促使白血病細胞大量增殖。而癌基因Myc家族一個引人注目的觀點是，對應于各種信號刺激行使驅(qū)動增殖的功能。在周期細胞中Myc過表達能減少對生長因子的需求，阻止周期細胞退出細胞周期，加速細胞分裂。在終末分化期間，Myc水平快速下降，且Myc的被迫表達能抑制多種類型細胞的終末分化。有證據(jù)顯

14、示，Myc能調(diào)節(jié)幾個控制G1-S轉(zhuǎn)換的基因，如激活編碼Id2、CDK4、cyclinD2、Cul1和cdc25A的基因。Id2是一個微蛋白(包括Rb)的負調(diào)節(jié)基因，因而能刺激細胞周期進程通過限制點，CDK4和cyclinD2的誘導能刺激cyclinD/CDK和cyclinE/CDK復合體，cdc25A編碼一種磷酸酶，它具有控制CDK2和活性狀態(tài)的作用。Myc依賴性調(diào)節(jié)導致cyclinD-和cyclinE-依賴性激酶的激活和微蛋白Rb的抑

15、制，因而促進了S期進程。 HL-60細胞是人的原粒細胞系(promyelocyticcell)，是應用最為廣泛的用來研究細胞生長及分化的體外模型。HL-60是非定向的前體細胞，具有分化為終末粒細胞或單核細胞的能力。經(jīng)ATRA誘導后，HL-60細胞可向成熟粒細胞方面發(fā)生分化。國內(nèi)外已有許多研究者利用ATRA誘導HL-60分化這一模型，對ATRA治療APL的一些特性進行了大量研究。為進一步探討HL-60細胞在ATRA誘導過程中的基因

16、表達變化情況。該研究首先利用ATRA誘導HL-60細胞產(chǎn)生分化模型，然后采用WST1方法和NBT還原試驗檢測了藥物對細胞增殖和分化的影響，流式細胞儀分析細胞周期，RT-PCR技術檢測藥物處理前后細胞內(nèi)幾種惡性腫瘤相關基因的mRNA表達變化情況。結果表明，HL-60細胞經(jīng)ATRA作用24小時后，細胞增殖明顯受到抑制，細胞周期停滯于G0/G1期，MMP-9、p53、HIF-1αmRNA表達呈增加趨勢，而c-Myc、VEGF、TIMP-1mR

17、NA表達呈現(xiàn)降低趨勢，MMP-2mRNA未見明顯表達。結論：1.HL-60細胞經(jīng)不同時間的ATRA誘導分化后，VEGFmRNA表達下降，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子c-MycmRNA及蛋白表達也下降，這兩種基因均與腫瘤細胞的增殖有關，因而可推測ATRA作用于HL-60細胞后，ATRA下調(diào)VEGF也許是通過下調(diào)c-Myc而進行的，c-Myc也許能促進VEGF的釋放;2.ATRA誘導HL-60細胞分化后，p53抑癌基因和HIF-1αmRNA表達均呈上升趨勢

18、，二者與VEGF的表達變化不一致，故二者不是促進VEGF釋放的轉(zhuǎn)錄因子。這兩種基因與細胞凋亡有密切的關聯(lián)，而已有研究證實ATRA的作用之一為誘導細胞凋亡，因此可推測ATRA作用于HL-60細胞后，可能通過p53及HIF-1α基因誘導腫瘤細胞凋亡;3.HL-60細胞經(jīng)ATRA誘導后，與細胞侵襲力有關的MMP-9表達上升，TIMP-1表達下降，提示ATRA藥物臨床作用的兩面性。對于進一步揭示臨床上維甲酸綜合癥的發(fā)生及發(fā)病機制具有重要的提示作