HL-60細(xì)胞ATRA誘導(dǎo)后MMP-9-TIMP-1及VEGF表達(dá)變化及意義的研究.pdf

1、急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)約占非淋巴系白血病的8％～15％，傳統(tǒng)治療以化療為主，并且是誘導(dǎo)緩解的有效方案。但化療，尤其是大劑量化療，可以增加感染或DIC等并發(fā)癥，往往引起早期死亡。而緩解后多次化療誘發(fā)的耐藥性，成為復(fù)發(fā)的主要原因之一，使得患者難以獲得再次緩解。因此，需要發(fā)掘新的更加有效和安全的藥物。在體外全反式維甲酸(all-transretinoicacidATRA)誘導(dǎo)HL-

2、60，U937和原代APL細(xì)胞發(fā)生終末分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，我國(guó)學(xué)者于1986年首次用ATRA治療APL并獲得成功，成為腫瘤誘導(dǎo)分化治療模式最為有效的范例，并由此被國(guó)際上稱之為白血病治療史上的一場(chǎng)“中國(guó)革命”。 ATRA治療APL的基本特點(diǎn)在于不殺傷腫瘤細(xì)胞，而是通過誘導(dǎo)惡性細(xì)胞向成熟階段分化，因而對(duì)機(jī)體正常組織損傷小，療效高，完全緩解率(CR)在80％～90％，并發(fā)癥少，無骨髓抑制，一般不誘發(fā)DIC。經(jīng)推廣應(yīng)用后，其良好療效已

3、被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所公認(rèn)。ATRA現(xiàn)已列為APL誘導(dǎo)緩解治療的首選藥物。 雖然ATRA通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化而使患者達(dá)到CR。但是患者在用ATRA期間，亦較易出現(xiàn)一些常見的并發(fā)癥，約有25％的患者用ATRA治療后出現(xiàn)維甲酸綜合征，其癥狀表現(xiàn)為不明原因發(fā)熱、體重增加、呼吸困難、肺間質(zhì)浸潤(rùn)等。此類癥狀與應(yīng)用ATRA后出現(xiàn)的高白細(xì)胞征有關(guān)。 近幾年內(nèi)，研究者們認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在血液系統(tǒng)疾病如白血病的發(fā)生中起了重要的作用

4、，當(dāng)不成熟細(xì)胞從骨髓向外周血釋放的過程中，MMPs尤其起了很重要的作用。部分研究結(jié)果表明：髓系細(xì)胞分化時(shí)MMP-9分泌增加，而人外周血中的正常淋巴細(xì)胞進(jìn)入外周組織時(shí)也伴有MMP-9分泌增加，推測(cè)與骨髓細(xì)胞成熟釋放有關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)26種，它們是鋅離子依賴的蛋白酶，能夠降解多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分。對(duì)腫瘤的發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有非常重要的作用。組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是M

5、MPs的天然抑制物，是一組能抑制MMPs活性的多功能因子，目前已在人體中發(fā)現(xiàn)4種TIMPs。MMPs與TIMPs之間的平衡關(guān)系在調(diào)節(jié)(細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的穩(wěn)定中有重要作用，它們參與了人體內(nèi)許多生理與病理過程。由于能夠降解ECM，MMPs與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及發(fā)展有密切的關(guān)系，幾乎在所有的人類及動(dòng)物腫瘤中MMPs表達(dá)均增加。MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用為：(1)破壞局部組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng);(2)破壞基底膜屏障，利于腫瘤轉(zhuǎn)移;(3)通過對(duì)

6、細(xì)胞外基質(zhì)的改建，促進(jìn)腫瘤新生血管形成。為了進(jìn)一步探討誘導(dǎo)成熟后粒細(xì)胞釋放增加是否與MMP-9/TIMP-1變化有關(guān)，該研究選擇急性早幼粒細(xì)胞株HL-60細(xì)胞進(jìn)行體外ATRA誘導(dǎo)分化，觀察MMP-9/TIMP-1與MMP-2的表達(dá)變化。 惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤新生血管形成有直接的關(guān)系。血管新生在腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。正常情況下，機(jī)體內(nèi)促血管新生因子與血管新生抑制因子處于一平衡狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生腫瘤性增殖時(shí)，促

7、血管新生因子的分泌增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，新生血管形成，為不斷增殖的腫瘤細(xì)胞提供氧氣及營(yíng)養(yǎng)成分。在目前已知的促血管生成因子中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是作用最強(qiáng)、特異性最高的一種因子，在腫瘤血管形成中起著重要作用。以往的研究主要集中于實(shí)體瘤，但最近的研究發(fā)現(xiàn)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤如白血病、多發(fā)性骨髓瘤患者中也存在著血管新生現(xiàn)象。因此，對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤血管新生的研究，將有助于對(duì)其發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解及將抗血管生成療法用于臨床治療

8、惡性血液系統(tǒng)疾病，從而進(jìn)一步提高其臨床療效，具有重要的意義。鑒于此，該項(xiàng)研究擬采用ATRA誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞分化后，除檢測(cè)MMP-9/TIMP-1及MMP-2的表達(dá)變化，同時(shí)檢測(cè)VEGF及與其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)變化，并探討其中的意義。 近年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因p53突變與VEGF的表達(dá)密切相關(guān)。p53是至今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，是當(dāng)前腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。人類惡性腫瘤中至少有50％發(fā)現(xiàn)了p53基

9、因的改變。野生型p53基因與細(xì)胞周期生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。野生型p53的抗腫瘤作用主要是阻滯G1/G0期使細(xì)胞不能進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖。另外，野生型p53基因可通過增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)某些DNA損傷制劑敏感性達(dá)到抗腫瘤目的，也可通過Bcl-2家族作用調(diào)控細(xì)胞凋亡?？傊?，很多重要的與細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因都被p53調(diào)控，p53基因作為一個(gè)重要的腫瘤抑制基因，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中都具有重要作用

10、。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多惡性腫瘤中p53基因突變和VEGF的表達(dá)密切相關(guān)。p53基因可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖活性及VEGF的表達(dá)，直接或間接影響腫瘤血管的生成。野生型p53(wtp53)能促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞血管形成抑制因子TSPmRNA的表達(dá)，而突變型p53(mtp53)能下調(diào)TSPmRNA的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)VEGFmRNA的表達(dá)。關(guān)于VEGF與p53基因表達(dá)的相關(guān)性在胃癌、肺腺癌等實(shí)體瘤中均有報(bào)道，但在APL白血病細(xì)胞中二者表達(dá)的相關(guān)性卻鮮有報(bào)

11、道。該項(xiàng)工作就此作了初步探討。 低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)是迄今為止發(fā)現(xiàn)唯一的特異性低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用機(jī)制正得到系統(tǒng)而深入研究。低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)廣泛參與低氧誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和HIF-1α具有密切關(guān)系，兩者均是由低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生，在許多種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，促進(jìn)局部組織對(duì)低氧的耐受及新生血管形成。HIF-1α調(diào)控的多種基因和蛋白均以不同方式參與

12、腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)過程，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞低氧環(huán)境下的生存能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。HIF-1α在多種實(shí)體腫瘤中均有表達(dá)，與腫瘤的惡性進(jìn)展有直接的關(guān)系。它在腫瘤進(jìn)展中的功能有：(1)促進(jìn)糖酵解;(2)促進(jìn)新生血管生成;(3)可能還參與了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程。(4)其它：除此外，HIF-1α還可誘導(dǎo)各種促紅細(xì)胞生成因子(轉(zhuǎn)鐵蛋白)、擴(kuò)血管因子等的表達(dá)來增加組織氧的運(yùn)輸和利用能力。研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)前急性期蛋白如血

13、漿銅藍(lán)蛋白的表達(dá)，因此HIF-1α可能還參與了應(yīng)急反應(yīng)。有關(guān)HIF-1α的研究已成為相關(guān)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 VEGF促進(jìn)新生血管形成，為白血病細(xì)胞提供養(yǎng)分，促使白血病細(xì)胞大量增殖。而癌基因Myc家族一個(gè)引人注目的觀點(diǎn)是，對(duì)應(yīng)于各種信號(hào)刺激行使驅(qū)動(dòng)增殖的功能。在周期細(xì)胞中Myc過表達(dá)能減少對(duì)生長(zhǎng)因子的需求，阻止周期細(xì)胞退出細(xì)胞周期，加速細(xì)胞分裂。在終末分化期間，Myc水平快速下降，且Myc的被迫表達(dá)能抑制多種類型細(xì)胞的終末分化。有證據(jù)顯

14、示，Myc能調(diào)節(jié)幾個(gè)控制G1-S轉(zhuǎn)換的基因，如激活編碼Id2、CDK4、cyclinD2、Cul1和cdc25A的基因。Id2是一個(gè)微蛋白(包括Rb)的負(fù)調(diào)節(jié)基因，因而能刺激細(xì)胞周期進(jìn)程通過限制點(diǎn)，CDK4和cyclinD2的誘導(dǎo)能刺激cyclinD/CDK和cyclinE/CDK復(fù)合體，cdc25A編碼一種磷酸酶，它具有控制CDK2和活性狀態(tài)的作用。Myc依賴性調(diào)節(jié)導(dǎo)致cyclinD-和cyclinE-依賴性激酶的激活和微蛋白R(shí)b的抑

15、制，因而促進(jìn)了S期進(jìn)程。 HL-60細(xì)胞是人的原粒細(xì)胞系(promyelocyticcell)，是應(yīng)用最為廣泛的用來研究細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的體外模型。HL-60是非定向的前體細(xì)胞，具有分化為終末粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的能力。經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后，HL-60細(xì)胞可向成熟粒細(xì)胞方面發(fā)生分化。國(guó)內(nèi)外已有許多研究者利用ATRA誘導(dǎo)HL-60分化這一模型，對(duì)ATRA治療APL的一些特性進(jìn)行了大量研究。為進(jìn)一步探討HL-60細(xì)胞在ATRA誘導(dǎo)過程中的基因

16、表達(dá)變化情況。該研究首先利用ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生分化模型，然后采用WST1方法和NBT還原試驗(yàn)檢測(cè)了藥物對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)藥物處理前后細(xì)胞內(nèi)幾種惡性腫瘤相關(guān)基因的mRNA表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，HL-60細(xì)胞經(jīng)ATRA作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，MMP-9、p53、HIF-1αmRNA表達(dá)呈增加趨勢(shì)，而c-Myc、VEGF、TIMP-1mR

17、NA表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，MMP-2mRNA未見明顯表達(dá)。結(jié)論：1.HL-60細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間的ATRA誘導(dǎo)分化后，VEGFmRNA表達(dá)下降，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子c-MycmRNA及蛋白表達(dá)也下降，這兩種基因均與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)，因而可推測(cè)ATRA作用于HL-60細(xì)胞后，ATRA下調(diào)VEGF也許是通過下調(diào)c-Myc而進(jìn)行的，c-Myc也許能促進(jìn)VEGF的釋放;2.ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化后，p53抑癌基因和HIF-1αmRNA表達(dá)均呈上升趨勢(shì)

18、，二者與VEGF的表達(dá)變化不一致，故二者不是促進(jìn)VEGF釋放的轉(zhuǎn)錄因子。這兩種基因與細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)聯(lián)，而已有研究證實(shí)ATRA的作用之一為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此可推測(cè)ATRA作用于HL-60細(xì)胞后，可能通過p53及HIF-1α基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;3.HL-60細(xì)胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后，與細(xì)胞侵襲力有關(guān)的MMP-9表達(dá)上升，TIMP-1表達(dá)下降，提示ATRA藥物臨床作用的兩面性。對(duì)于進(jìn)一步揭示臨床上維甲酸綜合癥的發(fā)生及發(fā)病機(jī)制具有重要的提示作