潛在磷酸化位點(diǎn)對(duì)AGV2 VP3凋亡功能的影響.pdf

1、新型環(huán)形病毒AGV2最早于2011年被檢測(cè)報(bào)道。AGV2基因組結(jié)構(gòu)與雞傳染性貧血病毒CAV相似，同樣編碼VP1、VP2和VP3蛋白。與CAV的VP3蛋白類(lèi)似，AGV2 VP3蛋白也已被證明具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。CAV的VP3蛋白中108位的蘇氨酸等關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)已被證明，不僅與VP3在腫瘤細(xì)胞的核定位有關(guān)，而且與VP3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞功能密切相關(guān)。那么在AGV2的VP3蛋白上是否也存在相應(yīng)的潛在磷酸化位點(diǎn)？這些位點(diǎn)是否對(duì)AGV2 VP

2、3蛋白的凋亡功能具有重要影響？為探究AGV2的VP3蛋白中可能的潛在磷酸化位點(diǎn)對(duì)AGV2 VP3凋亡功能影響，本研究在預(yù)測(cè)AGV2 VP3蛋白中4個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了真核表達(dá)載體的構(gòu)建，并評(píng)價(jià)了這4個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)對(duì)AGV2 VP3凋亡功能影響。
　　一、AGV2 VP3蛋白不同潛在磷酸化位點(diǎn)變體構(gòu)建
　　為了研究磷酸化位點(diǎn)對(duì)AGV2 VP3蛋白的凋亡功能作用，根據(jù)CAV的VP3蛋白中已驗(yàn)證的與凋亡功能相關(guān)的磷酸

3、化位點(diǎn)，利用overlap PCR技術(shù)將AGV2 VP3基因上的4個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)包括61位的蘇氨酸、90位的絲氨酸、91位的絲氨酸以及111位的蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，并克隆獲得了與EGFP蛋白融合的4個(gè)AGV2 VP3變體pCEGFP-AGV2VP3T61A、pCEGFP-AGV2 VP3S90A、pCEGFP-AGV2 VP3S91A和pCEGFP-AGV2VP3T111A。通過(guò)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別用抗AGV2 VP3抗體以及GFP

4、抗體對(duì)4個(gè)VP3變體的表達(dá)進(jìn)行了Western Blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四個(gè)變體均能很好的表達(dá)VP3蛋白。在Western Blot中可見(jiàn)42kD處有特異性條帶。四個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)VP3變體的構(gòu)建及表達(dá)為進(jìn)一步研究磷酸化位點(diǎn)對(duì)AGV2 VP3凋亡功能的影響打下了基礎(chǔ)。
　　二、不同潛在磷酸化位點(diǎn)對(duì)AGV2 VP3凋亡功能影響
　　為檢測(cè)潛在磷酸化位點(diǎn)對(duì)AGV2 VP3凋亡功能的影響，將獲得的表達(dá)4個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)變體的VP3

5、的陽(yáng)性質(zhì)粒pCEGFP-AGV2VP3T61A、pCEGFP-AGV2 VP3S90A、pCEGFP-AGV2 VP3S91A和pCEGFP-AGV2 VP3T111A，以及野生型pCEGFP-AGV2 VP3分別轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、正常雞胚成纖維細(xì)胞CEF以及DF1細(xì)胞。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，AGV2 VP3及其變體在HCT116以及DF1細(xì)胞均定位于細(xì)胞核內(nèi)，且呈散在的點(diǎn)狀分布，類(lèi)似凋亡小體;而在CEF中在胞漿及胞

6、核均有表達(dá)。利用AnnexinV-PE/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VP3凋亡發(fā)現(xiàn)，pCEGFP-AGV2 VP3T61A、pCEGFP-AGV2VP3S90A、pCEGFP-AGV2 VP3S91A和pCEGFP-AGV2 VP3T111A對(duì)HCT116細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡比率比對(duì)照EGFP質(zhì)粒高10％-20％。在檢測(cè)caspase活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，AGV2 VP3及其各變體的活性值是對(duì)照EGFP的1.5倍到2倍。這些結(jié)果表明，所檢測(cè)的4個(gè)潛在磷酸化位