299位點絲氨酸磷酸化對Hsf4b轉錄活性的調控.pdf

1、背景：眼睛晶狀體發(fā)生任意程度的渾濁皆可被稱為白內障。在晶狀體發(fā)育過程中，其上皮或纖維細胞結構發(fā)生改變，晶狀體蛋白組成異常均可以導致白內障的發(fā)生[1~3]。白內障是目前人類致盲的主要原因，根據發(fā)病年齡不同可以細分為先天性白內障和老年性白內障，老年性白內障的發(fā)生率已達到60％-70%。隨著我國社會老齡化趨勢不斷增強，預防和治療老年型白內障的發(fā)生已經成為亟待解決的科學問題。外界環(huán)境刺激導致晶狀體細胞損傷是白內障發(fā)生的一個重要原因。為應對外界環(huán)

2、境的諸多刺激，細胞通過熱休克轉錄因子（Hsfs）大量啟動熱休克蛋白（Hsps）的表達，保護細胞，促進其存活。熱休克轉錄因子4（Heat Shock Factor4，HSF4）是熱休克轉錄因子家族（HSF）的一員，通過選擇性剪切形成了兩種不同的剪切形式：Hsf4a和Hsf4b。遺傳學分析表明 Hsf4突變與先天性家族白內障和老年性白內障的發(fā)生相關。敲除小鼠Hsf4基因可導致新生期小鼠白內障的發(fā)生。在小鼠中，Hsf4敲除后，導致晶狀體上皮細

3、胞增殖異常，纖維細胞分化不完全，這些數據說明 Hsf4參與調控晶狀體纖維細胞分化進程，但是具體機制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)Hsf4在晶狀體中高表達[4,5]，并且Hsf4b是晶狀體中Hsf4存在的唯一剪切形式[20]。Hsf4b主要表達于晶狀體上皮細胞和次級纖維細胞內，并在晶狀體形成和分化過程中起重要作用。已報道Hsf4b蛋白可發(fā)生磷酸化、Sumo化（類泛素化）、乙?；榷喾N翻譯后修飾。Hsf4b/T472位點的磷酸化修飾參與調控Hsf4b與

4、入核因子inportin beta-1的相互作用，進而調控 Hsf4b的入核和轉錄活性[22]。我們之前的研究也表明 Hsf4b/S299位點的磷酸化調控Hsf4b與轉錄抑制因子DAXX的相互作用[20]。并且該位點的磷酸化修飾對Hsf4b的轉錄活性起抑制作用。Lea Sistonen等發(fā)現(xiàn)Hsf4b也可以被sumo化修飾，進而調控其轉錄活性，并且Hsf4b的Sumo化依賴于Hsf4b/S299的磷酸化修飾，即Hsf4b存在一個磷酸化依

5、賴的Sumo化結構域[19]。Hsf4b/S299A可以上調Gal-Hsf4融合蛋白的轉錄活性，這些研究的結果說明磷酸化S299對Hsf4b轉錄活性起抑制作用，但是，這一結論都是以腫瘤細胞為研究材料而獲得的，并且受磷酸化Hsf4b/S299抑制的自然靶向下游基因也不清楚。我們的研究結果發(fā)現(xiàn)在小鼠晶狀體上皮細胞內，Hsf4b參與上調小分子伴侶蛋白Hsp25和alphaB-crystallin基因表達，同時還能抑制Hsp70的表達。本課題通

6、過定點突變的方法構建Hsf4b/S299位點的突變質粒，利用小鼠晶狀體上皮細胞構建Hsf4b/S299A（D）突變穩(wěn)定細胞株，檢測 Hsf4b/S299突變后在晶狀體上皮細胞內，對Hsf4b轉錄活性的影響，并且進一步探討該突變影響Hsf4b轉錄活性的具體作用機制。
　　目的：在晶狀體上皮細胞內，探討突變 Hsf4b/S299A（D）位點對Hsf4b轉錄活性的調控機理。
　　方法：⑴設計Hsf4b/S299位點突變引物，通過定

7、點突變的方法構建 Hsf4b/S299A和Hsf4b/S299D突變質粒pWZL-blast-Hsf4b/S299A和pWZL-blast-Hsf4b/S299D。⑵將pWZL-blast-HA-Hsf4b/ S299A、pWZL-blast-HA-Hsf4b/S299D、空載質粒pWZL-blast和正常質粒正常質粒 pWZL-blast-HA-Hsf4b分別轉染病毒包裝細胞293-phoenix，利用其分泌的病毒上清感染 Hsf4b

8、敲除的晶狀體上皮細胞（mLEC/Hsf4b-/-），最后用藥物（Blasticidin）篩選獲得野生型和突變型Hsf4b持續(xù)表達的穩(wěn)定細胞株。⑶Western Blot和Realtime-PCR驗證穩(wěn)定細胞株中Hsf4b/S299突變對其下游蛋白（Hsp25、αB-crystallin和Hsp70）表達的影響。⑷放線菌酮（CHX）處理Hs4b/S299野生型和突變型穩(wěn)定株細胞，檢測Hsf4b/S299突變后是否影響Hsf4b蛋白的半衰期

9、及穩(wěn)定性。⑸Hsp70和αB-crystallin promoter的luciferase assay檢測Hsf4b、Hsf4b/S299A和Hsf4b/S299D突變與hsp70和αB-crystallin基因啟動子的DNA結合能力。⑹Chromatin Immunoprecipitation（CHIP）Assay直接檢測Hsf4b、Hsf4b/S299A和Hsf4b/S299D突變與下游基因啟動子DNA結合能力。⑺細胞免疫熒光實驗檢

10、測Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D突變對Hsf4b細胞定位的影響。
　　結果：①成功構建pWZL-blast-HA-Hsf4b/S299A、pWZL-blast-HA-Hsf4b/S299D兩個突變質粒。②成功構建持續(xù)穩(wěn)定表達野生型Hsf4b和突變型Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D的小鼠晶狀體上皮細胞穩(wěn)定株。③Realtime-PCR實驗表明 Hsf4b上調小分子熱休克蛋白 hsp25和αB-cryst

11、allin的mRNA水平而Hsf4b/S299A突變進一步上調其mRNA水平，Hsf4b/ S299D突變對小分子熱休克蛋白hsp25和αB-crystallin的mRNA水平的調控作用與Hsf4b中無差異。Hsf4b下調Hsp70的mRNA水平，相反Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D失去下調Hsp70 mRNA水平的能力。④Western Blot實驗表明，Hsf4b上調小分子熱休克蛋白hsp25和αB-crystalli

12、n的蛋白水平，而Hsf4b/S299A能夠進一步明顯上調它們的蛋白水平，相反Hsf4b/S299D不能進一步上調它們的蛋白水平。同時，Hsf4b下調Hsp70的蛋白水平，而Hsf4b/S299A失去下調Hsp70蛋白水平的能力，Hsf4b/S299D對下調Hsp70的蛋白水平沒明顯改變。⑤野生型Hsf4b和突變型Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D相比，目的蛋白Hsf4b/S299A的蛋白穩(wěn)定性降低，Hsf4b/S299D蛋白

13、相對于Hsf4b/S299A蛋白較穩(wěn)定。⑥Luciferase Assay和CHIP實驗表明Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D突變影響Hsf4b與Hsp70基因啟動子和αB-crystallin基因啟動子的DNA結合調控能力。Hsf4b/S299A突變使其與DNA結合能力增強，Hsf4b/S299D突變與其DNA結合能力與Hsf4b中相比無明顯差異。⑦免疫熒光結果顯示晶狀，體上皮細胞穩(wěn)定株中Hsf4bS299A、Hsf4b/