雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機(jī)制研究.pdf

1、腎癌發(fā)源于泌尿小管上皮，是成人中常見的惡性腫瘤之一。早期可以手術(shù)切除，但術(shù)后一部分患者仍然發(fā)生轉(zhuǎn)移，晚期則失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)，并且缺乏特效治療方法。雖然細(xì)胞因子及分子靶向藥物等對(duì)腎癌有一定的療效，但總體效果均不夠理想。而惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因的功能改變密切相關(guān)，因此探索基因療法具有積極意義，也是腎癌治療的長期研究熱點(diǎn)。
　　NPRL2(nitrogen permease regulator-like2)是近年來新發(fā)現(xiàn)與熱點(diǎn)研究的抑

2、癌基因之一，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。課題組前期發(fā)現(xiàn)NPRL2在腎癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織明顯下降，轉(zhuǎn)染外源性NPRL2基因?qū)δI癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，提示NPRL2在腎癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色。但利用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)肽[瘤宿主細(xì)胞，存在轉(zhuǎn)染效率低、基因突變及丟失等一系列問題，而新的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽CTP可高效攜帶蛋白質(zhì)穿透胞膜并專性定位于胞漿，提供了解決問題的可能性。在基因治療研究中，應(yīng)用的載體系統(tǒng)主要有病毒和

3、非病毒（脂質(zhì)體等）兩大類，前者存在病毒滴度低、缺乏安全性與引起突變等缺點(diǎn)，后者也存在缺乏腫瘤靶向性、轉(zhuǎn)染效率低等缺點(diǎn)，而雙歧桿菌為腸道重要的厭氧益生菌，對(duì)腫瘤低氧區(qū)具有特異靶向性，是一種良好的腫瘤基因治療靶向載體。
　　本課題在前期基礎(chǔ)之上對(duì)抑癌基因NPRL2進(jìn)行深一步的研究，利用CTP顯著的胞漿定位與高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)潛能，率先提出了“通過NPRL2與CTP融合表達(dá)來實(shí)現(xiàn)外源性NPRL2蛋白“內(nèi)源化”的策略。通過原核表達(dá)CTP-NPRL

4、2融合蛋白，利用CTP的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能將NPRL2蛋白轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞后觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，同時(shí)以雙歧桿菌為載體在裸鼠腎癌模型上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以評(píng)估療效，最終運(yùn)用基因芯片、蛋白質(zhì)譜等技術(shù)初步揭示雙歧桿菌介導(dǎo) CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機(jī)制，以期為腎癌尋找到一種新的基因治療方法。本論文總共分兩部分。
　　第一部分、CTP轉(zhuǎn)導(dǎo)NPRL2蛋白對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O生物學(xué)行為的影響
　　目的：證實(shí)CTP能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)NPRL2蛋白進(jìn)入人腎

5、癌細(xì)胞786-O并對(duì)該細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。
　　方法：
　　1.構(gòu)建重組質(zhì)粒pET15b-CTP-NPRL2、pET15b-NPRL2并分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并Western blot驗(yàn)證。
　　2.FITC分別標(biāo)記CTP-NPRL2和NPRL2兩種蛋白，激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白在細(xì)胞中的定位，F(xiàn)ACS檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
　　3.根據(jù)作用蛋白的不同將實(shí)驗(yàn)分為CTP-NPR

6、L2組、NPRL2組及空白對(duì)照組，每組均處理786-O，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，F(xiàn)ACS檢測細(xì)胞周期與凋亡，Transwell法檢測細(xì)胞侵襲及遷移能力。
　　結(jié)果：
　　1.重組質(zhì)粒pET15b-CTP-NPRL2、pET15b-NPRL2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)Western blot驗(yàn)證能夠表達(dá)出目的蛋白。
　　2.激光共聚焦顯微鏡顯示CTP-NPRL2組細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光并顯著定位于胞漿，而NPRL

7、2組及空白對(duì)照組未見綠色熒光。FACS顯示CTP-NPRL2融合蛋白以75%左右的高效率轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞786-O，而NPRL2蛋白幾乎不能進(jìn)入該細(xì)胞。
　　3.與NPRL2組及空白對(duì)照組相比，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)CTP-NPRL2組細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05），F(xiàn)ACS顯示CTP-NPRL2組的凋亡率顯著增高（P＜0.01）且處于G0/G1期細(xì)胞明顯增多（P＜0.05），Transwell顯示CTP-NPRL2組細(xì)胞侵襲及遷移

8、能力明顯降低（P＜0.01）。同時(shí)CTP-NPRL2融合蛋白隨其濃度增加而作用增強(qiáng)。NPRL2組與空白對(duì)照組以上比較均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：CTP能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)NRPL2蛋白進(jìn)入腎癌細(xì)胞786-O并對(duì)該細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤抑制作用，并且隨CTP-NPRL2融合蛋白濃度增加而作用增強(qiáng)。
　　第二部分、雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的療效及機(jī)制研究
　　目的：探討雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠

9、腎癌模型的療效，并利用基因芯片與蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果綜合分析的策略探索相應(yīng)的分子機(jī)制，以期從整體水平上揭示該治療方法的作用原理，并篩選出關(guān)鍵性的靶基因。
　　方法：
　　1.786-O細(xì)胞懸液皮下注射法構(gòu)建裸鼠腎癌模型，通過病理切片證實(shí)模型是否構(gòu)建成功。
　　2.厭氧法培養(yǎng)嬰兒雙歧桿菌，電轉(zhuǎn)法將重組質(zhì)粒pET15b-CTP-NPRL2、pET15b-NPRL2及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)雙歧桿菌，Western blot驗(yàn)證目的蛋白

10、的表達(dá)。
　　3.將建模成功的裸鼠腎癌模型40只按處理因素不同隨機(jī)分為5組：雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組、雙歧桿菌+pET15b-NPRL2組、雙歧桿菌+pET15b組、雙歧桿菌組與生理鹽水組，每組8只，尾靜脈注射各菌液或生理鹽水，每周1次，共4次。
　　4.通過觀察裸鼠重量、瘤體重量、雙腎重量及TUNEL檢測腫瘤組織凋亡情況以評(píng)估療效。
　　5.基因芯片與蛋白質(zhì)譜檢測分別尋找經(jīng)雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NP

11、RL2處理后的裸鼠腎癌組織差異表達(dá)基因與蛋白，并進(jìn)行 GO、Pathway、Pathway-network等生物信息學(xué)分析，結(jié)合閱讀文獻(xiàn)，推斷雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機(jī)制。
　　6.篩選出可能的靶點(diǎn)基因，Real time-PCR、Western blot驗(yàn)證表達(dá)。
　　7.選取代表性的靶基因，構(gòu)建3條針對(duì)該基因的干擾 siRNA序列以及1條無義siRNA序列，Real time-PCR篩選最適干擾s

12、iRNA序列；構(gòu)建針對(duì)該基因的重組質(zhì)粒。
　　8.探討代表性靶基因?qū)?86-O生物學(xué)行為的影響，將實(shí)驗(yàn)分為干擾siRNA組、無義siRNA組、空白對(duì)照組、重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組，處理786-O細(xì)胞，Real time-PCR和Western Blot檢測每組代表性基因的表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，F(xiàn)ACS檢測細(xì)胞周期與凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.裸鼠皮下生長出腫塊并經(jīng)病理切片證實(shí)為腎癌。
　　2.電轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒p

13、ET15b-CTP-NPRL2、pET15b-NPRL2及空質(zhì)粒后雙歧桿菌能夠良好生長，經(jīng)Western blot驗(yàn)證表達(dá)出目的蛋白。
　　3.雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組裸鼠重量明顯改善，瘤體重量減輕，與其余任意一組相比具有顯著差異(均 P＜0.01)，而剩余各組之間無明顯差異(均 P＞0.05)，雙腎重量在各組間亦無明顯差異(均P＞0.05)。雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組凋亡率（26.8±4.1

14、5）%與生理鹽水組凋亡率（11.6±3.58）%有顯著差異(P＜0.01)。
　　4.基因芯片篩選出雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組與生理鹽水組腎癌組織差異表達(dá)2倍以上基因565個(gè)，其中313個(gè)在雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組表達(dá)上調(diào)，252個(gè)表達(dá)下調(diào)；GO分析顯著富集的Term中與腫瘤相關(guān)的有：細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞增殖的調(diào)控、細(xì)胞遷移的調(diào)控等；Pathway分析顯著富集的Term中與腫瘤相

15、關(guān)的有：細(xì)胞外基質(zhì)組建、G0/G1早期、整合素介導(dǎo)的細(xì)胞表面相互粘附、細(xì)胞周期等；Pathway-network分析處于中心地位的Term為：MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞周期。
　　5.蛋白質(zhì)譜篩選出雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組與生理鹽水組腎癌組織表達(dá)差異1.5倍以上蛋白560個(gè)，其中79個(gè)在雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組表達(dá)上調(diào)，481個(gè)表達(dá)下調(diào)；GO分析顯著富集的Term中與腫

16、瘤相關(guān)的有：細(xì)胞外膜泡小體、Rac信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯起始、細(xì)胞外基質(zhì)成分等；Pathway分析顯著富集的Term中與腫瘤相關(guān)的有：β1整合素細(xì)胞表面相互作用、Ras通路、C-MYB轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)、膠原降解等；Pathway-network分析處于中心地位的Term為：MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路。
　　6.選取出四個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)基因：ANXA1、PRMT1、TIAL1、ANGPTL2。Real time-PCR驗(yàn)

17、證結(jié)果顯示雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組 ANXA1表達(dá)增高約1.86倍，而TIAL1、PRMT1、ANGPTL2基因表達(dá)分別下降約1.77、2.24、19.56倍；Western blot驗(yàn)證結(jié)果基本一致。
　　7.選取出差異倍數(shù)最大的ANGPTL2進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)功能驗(yàn)證，CCK-8顯示重組質(zhì)粒組細(xì)胞增殖明顯增加，干擾siRNA組細(xì)胞增殖明顯減少。
　　8.FACS顯示各組細(xì)胞凋亡率分別是(10.06±0.2

18、7)%、(2.93±0.30)%、(2.99±0.11)%、(1.98±0.11)%、(3.13±0.08)%。重組質(zhì)粒組與其余任意一組相比有顯著性差異(均P＜0.01)，同理干擾siRNA組；而其余三組任意兩組相比無顯著性差異(均P＞0.05)。各組處于G0/G1期的細(xì)胞比例分別是(69.32±2.45)%、(54.89±0.48)%、(54.22±2.7)%、(46.57±0.13)%、(56.05±4.29)%。重組質(zhì)粒組與其余任

19、意一組相比有顯著性差異(均P＜0.01)，同理干擾siRNA組；而其余三組任意兩組相比無顯著性差異(均P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.雙歧桿菌-CTP-NPRL2能夠抑制裸鼠腎癌的生長，增加腎癌組織的凋亡并改善裸鼠體重。
　　2.雙歧桿菌-CTP-NPRL2調(diào)節(jié)了包括ANXA1、PRMT1、TIAL1、ANGP TL2在內(nèi)的一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因涉及癌基因、抑癌基因、增殖與凋亡相關(guān)基因、細(xì)

20、胞周期相關(guān)基因、血管生長基因等。
　　3.ANGPTL2具有癌基因功能，過表達(dá)能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞786-O的增殖、減少凋亡，而抑制表達(dá)則降低該細(xì)胞的增殖、增加凋亡；同時(shí)抑制ANGPTL2表達(dá)能阻滯腎癌細(xì)胞786-O細(xì)胞周期于G0/G1期，反之則結(jié)果相反。
　　4.在雙歧桿菌-CTP-NPRL2調(diào)節(jié)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因中，對(duì)ANGPTL2基因表達(dá)的抑制發(fā)揮了重要作用。
　　5.雙歧桿菌-CTP-NPRL2可能主要