雙歧桿菌對(duì)內(nèi)毒素?fù)p傷幼年大鼠腸道保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、本研究以腹腔注射內(nèi)毒素(LPS)致幼鼠腸損傷為研究對(duì)象，應(yīng)用分子生物學(xué)、組織化學(xué)及病理形態(tài)學(xué)的研究方法動(dòng)態(tài)觀察幼鼠腸損傷的形態(tài)學(xué)演變過程，研究幼鼠血清和回腸組織的氧自由基損傷、炎癥介質(zhì)損傷以及腸道的非特異免疫和IGF-1的保護(hù)機(jī)制，同時(shí)探討外源性雙歧桿菌對(duì)回腸組織的保護(hù)機(jī)制，為臨床上預(yù)防胃腸功能障礙患兒發(fā)展為MODS/SIRS提供新的治療手段和理論支持。 材料和方法 一、動(dòng)物模型 健康18同齡Wistar大鼠隨機(jī)

2、分為3組，對(duì)照組(C組)腹腔注射生理鹽水(1ml/kg)，模型組(E組)腹腔注射內(nèi)毒素(LPS，5mg/kg，用生理鹽水配成5mg/ml)；治療組(T組)注射LPS前1周給予雙歧桿菌混懸液(2.0x10<'9>CFU/ml)灌胃，每次0.5ml，每日2次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。要補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)過程中死亡動(dòng)物，以達(dá)到所設(shè)定的標(biāo)本數(shù)(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只)。 二、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及處理 分別于腹腔注射內(nèi)毒素或生理鹽水后2、6、12、24和72h

3、斷頭處死動(dòng)物，按以下方法留取和保存血清和回腸組織。 1、斷頭取血，離心(3500 r/min)1.5min，取血清-20℃保存，用于組織化學(xué)測定。 2、冰生理鹽水沖洗腸腔內(nèi)容物后，留取距回盲部2-3cm處回腸0.5-1cm，置于0.1mol/L PBS配置的4％多聚甲醛溶液中固定，用于H-E染色后觀察組織病理學(xué)改變和免疫組織化學(xué)研究。 3、留取距回盲部3-4cm處回腸2-3cm，置于去RNA酶的Eppendorf

4、管中，放入液氮后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中，用于提取總RNA后進(jìn)行RT-PCR研究。 4、余下近回盲部回腸用濾紙吸干水分后，稱重，用生理鹽水或勻漿介質(zhì)制成5％組織勻漿，離心(3000r/min)10min，留上清-20℃保存，用于組織化學(xué)測定。 三、實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo) (一)回腸形態(tài)學(xué)研究 1、大體觀察觀察 腹腔注射LPS或生理鹽水后各組動(dòng)物的反應(yīng)情況；各組動(dòng)物于各時(shí)間點(diǎn)處死后，剖開腹腔，觀察腸管顏色、有

5、無水腫、出血及擴(kuò)張。 2、光鏡觀察 固定后的回腸組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，做4-5μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精.伊紅(H-E)染色，光鏡下觀察腸組織形念學(xué)改變。 (二)組織化學(xué)方法檢測血清和回腸組織SOD、MDA和MPO含量。 (三)免疫組織化學(xué)方法檢測回腸組織胰島素樣生長因子(IGF-1)和細(xì)胞問黏附分子-1 (ICAM-1)蛋白質(zhì)表達(dá)。 (四) RT-PCR法檢測回腸防御素-5 (Defensin-

6、5)、IGF-1 和ICAM-1 mRNA表達(dá)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)法，P<0.05提示差異有顯著性意義。 結(jié)果 一、各實(shí)驗(yàn)組幼鼠回腸組織病理形態(tài)學(xué)改變 (一)大體改變動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可見注射LPS后幼鼠出現(xiàn)懶動(dòng)、萎靡、食欲下降，1-2h出現(xiàn)腹脹、腹瀉，6-12h時(shí)上述癥狀加重，同時(shí)出現(xiàn)呼吸急促，口唇青紫，少動(dòng)，體毛凌亂、少光

7、澤，嚴(yán)重者抽搐，四肢青紫，周身涼，甚至死亡。存活者24h時(shí)上述癥狀部分緩解，72h基本恢復(fù)正常；提前給予雙歧桿菌菌懸液灌胃的幼鼠癥狀較模型組輕，且恢復(fù)快。動(dòng)物處死后，剖開腹腔可見對(duì)照組幼鼠腸管有光澤，顏色正常(淡黃色)；LPS組可見胃潴留明顯，腸壁及腸系膜充血，腸管擴(kuò)張、水腫，腸腔滲出物增多，嚴(yán)重者見腸壁點(diǎn)、片狀出血，以6h組表現(xiàn)明顯；雙歧桿菌組幼鼠腸管所見較LPS組減輕。 (二)H-E染色后光鏡下變化對(duì)照組小腸絨毛完整；內(nèi)毒素

8、組腹腔注射LPS后2h無明顯異常，6h可見小腸絨毛腺體脫落、缺失，紋狀緣變薄或缺失，腸絨毛高矮不一，密度減低，固有層毛細(xì)血管充血，炎細(xì)胞浸潤，12h部分腸絨毛上皮細(xì)胞開始修復(fù)，24h修復(fù)明顯，72h基本正常；雙歧桿菌組腹腔注射LPS后2h未見明顯異常，6h時(shí)可見小腸絨毛損傷，但是部分絨毛上皮細(xì)胞有修復(fù)，部分腸管杯狀細(xì)胞分泌亢進(jìn)，12h修復(fù)明顯，24h基本修復(fù)或正常，72h修復(fù)完全或正常。 二、各實(shí)驗(yàn)組幼鼠血清和回腸組織SOD、M

9、DA及MPO含量的變化 (一)血清和回腸組織SOD活性變化LPS組血清SOD活性在6h、12h和24h與對(duì)照組比較有顯著降低(P<0.05)，雙歧桿菌組SOD活性在2h、6h、12h及24h與LPS組比較有顯著升高(P<0.05)。 LPS組回腸組織SOD活性在6h、12h和24h與對(duì)照組比較有顯著降低(P<0.05)，雙歧桿菌組SOD活性在6h和12h與LPS組比較有顯著升高(P<0.05)。 (二)血清和回腸

10、組織MDA含量變化LPS組血清MDA含量在6h、12h和24h與對(duì)照組比較有顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌組MDA含量在6h、12h及24h與LPS組比較有顯著下降(P<0.05)。 LPS組回腸組織MDA含量在6h、12h和24h與對(duì)照組比較有顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌組MDA含量在12h和24h與LPS組比較有顯著降低(P<0.05)。 (三)血清和回腸組織MPO含量變化LPS組血清MPO含量在6h、12

11、h和24h與對(duì)照組比較有顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌組MPO含量在6h和12h與LPS組比較有顯著降低(P<0.05)LPS組回腸組織MPO含量在2h、6h和12h與對(duì)照組比較有顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌組MPO含量在6h和12h與LPS組比較有顯著下降(P<0.05) 三、各實(shí)驗(yàn)組幼鼠回腸組織Defensin-5、IGF-1和ICAM-1的分子生物學(xué)變化 (一)回腸組織Defensin-5 mRNA的表

12、達(dá)對(duì)照組回腸有少量Defensin-5 mRNA的表達(dá)，而模型組在LPS注射后2h表達(dá)明顯增加，6h達(dá)高峰，以后各時(shí)問點(diǎn)的表達(dá)逐漸下降，在2h、6h及12h與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)；雙歧桿菌組Defensin-5的表達(dá)在LPS注射后2h較模型組下降，6h、12h及24h下降明顯(P<0.05)。雙歧桿菌組與對(duì)照組比較，在2h和6h均比對(duì)照組增加，其中在2h差異明顯(P<0.05)，以后逐漸下降至正常。 (二)回腸組織

13、IGF-1蛋白和mRNA表達(dá) 1、回腸組織IGF-1蛋白表達(dá)對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有一定的IGF-1表達(dá)，表現(xiàn)為腸黏膜隱窩及上皮細(xì)胞較多量棕褐色顆粒；內(nèi)毒素組IGF-1表達(dá)較對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均減少，以12、24和72h為著(P<0.05)，雙歧桿菌治療組IGF-1表達(dá)在6h開始較內(nèi)毒素組增加，以12、24和72h為著(P<0.05)，雙歧桿菌組在6、12和24h表達(dá)較對(duì)照組增多，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義。 2、回腸組織IGF-1

14、mRNA的表達(dá)對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)回腸有較多量的IGF-1mRNA表達(dá)；內(nèi)毒素組回腸IGF-1mR/NA表達(dá)較對(duì)照組減少，以6、12、24和72h為著(P<0.05)；雙歧桿菌治療組回腸IGF-1mRNA表達(dá)從6h以后較內(nèi)毒素組增加明顯(P<0.05)，其中12和24h較對(duì)照組增加，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義。 (三)回腸組織ICAM-1蛋白和mRNA表達(dá) 1、回腸組織ICAM-1蛋白表達(dá)回腸ICAM-1的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：對(duì)

15、照組小腸黏膜間質(zhì)可見少量棕黃色顆粒，模型組小腸黏膜間質(zhì)均有棕黃色顆粒，以6h為著，免疫組織化學(xué)平均光密度值在6h、12h、24h和72h均較對(duì)照組有顯著性差異(P<0.01)，雙歧桿菌組小腸黏膜間質(zhì)棕黃色顆粒與模型組比較先增加而后逐漸減少，在6h和12h光密度值較模型組增加(P<0.01)，以后逐漸下降，在72h低于模型組(P<0.01)，而與對(duì)照組則無顯著性差異。 2、回腸組織ICAM-1 mRNA的表達(dá)對(duì)照組回腸有少量IC

16、AM-1 mRNA的表達(dá)，而模型組在LPS作用2h后表達(dá)明顯增加(P<0.01)，以后各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組無顯著性差異；雙歧桿菌組在注射LPS 2h較模型組表達(dá)下降(P<0.01)而與對(duì)照組無顯著性差異，在6h和12h表達(dá)較模型組明顯增加(P<0.01)，24h下降明顯，與對(duì)照組和模型組比較均有顯著性差異(P<0.01)，72h回升至正常。 結(jié)論 1.、雙歧桿菌能減輕內(nèi)毒素?fù)p傷幼鼠的回腸組織病理學(xué)改變，并能促進(jìn)組織損傷的修復(fù)

17、。 2、內(nèi)毒素?fù)p傷幼鼠血清和回腸組織SOD活性降低、MDA含量增加，雙歧桿菌能增加SOD活性，同時(shí)降低MDA含量，表明雙歧桿菌能通過抑制脂質(zhì)過氧化損傷而對(duì)幼鼠有一定的保護(hù)作用。 3、內(nèi)毒素?fù)p傷幼鼠血清和回腸MPO含量增加，同時(shí)回腸組織ICAM-1蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)增加，外源性給予雙歧桿菌能降低內(nèi)毒素組MlPO和ICAM-1的增加，表明雙歧桿菌能通過抑制大鼠體內(nèi)的MPO含量和ICAM-1的表達(dá)而保護(hù)腸道。 4、內(nèi)