CTP-NPRL2融合蛋白對(duì)腎癌原代細(xì)胞遷移侵襲能力的影響.pdf

1、目的：
　　將原核表達(dá)的NPRL2（Nitrogen permease regulator2-like）融合蛋白通過(guò)胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽（Cytoplasmic transduction peptide，CTP）轉(zhuǎn)入到腎癌原代細(xì)胞胞漿內(nèi)，觀察其對(duì)腎癌原代細(xì)胞遷移侵襲能力的影響，并觀察其與腎癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的關(guān)系。
　　方法：
　　分別使用IV型膠原酶消

2、化與在濾網(wǎng)上研磨的方法培養(yǎng)腎癌原代細(xì)胞；構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET15b-CTP-NPRL2和pET15b-NPRL2，表達(dá)融合蛋白CTP-NPRL2和NPRL2，并通過(guò)western blot鑒定融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白的定位情況；通過(guò)遷徙侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)導(dǎo)入融合蛋白后，對(duì)腎癌原代細(xì)胞的影響；Real-Time PCR檢測(cè)Raptor、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin mRNA表達(dá)水平；Wes

3、tern Blot檢測(cè)Raptor、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　培養(yǎng)出腎癌原代細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)與免疫組化鑒定；Western Blot結(jié)果提示重組質(zhì)粒成功表達(dá)出目的融合蛋白；免疫熒光提示CTP-NPRL2融合蛋白可以穿過(guò)胞膜并定位于胞漿；遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示CTP-NPRL2組腎癌細(xì)胞遷移侵襲能力明顯降低；Real-Time PCR和Western Blot

4、顯示CTP-NPRL2組 Raptor、Vimentin與 Fibronectin的mRNA、蛋白表達(dá)水平與NPRL2組和BLANK組相比降低（P＜0.05），而E-cadherin的mRNA、蛋白表達(dá)水平與NPRL2組與BLANK組相比升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　NPRL2可以影響腎癌原代細(xì)胞遷移能力，可能是通過(guò)對(duì)Raptor表達(dá)的影響，改變mTORC1活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)量，改變了EMT進(jìn)程，進(jìn)