ABCE1基因?qū)π〖?xì)胞肺癌增殖、侵襲、遷移能力影響的研究.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文ABCE1基因?qū)π〖?xì)胞肺癌增殖、侵襲、遷移能力影響的研究姓名：黃波申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：胸外科指導(dǎo)教師：田大力20090401ABCElSiRNA2、pEGFPCl、ABCElSiRNAN轉(zhuǎn)染入小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48d時(shí)后應(yīng)用Westernblot及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ABCEl蛋白表達(dá)。MTT法、Transwclld、室、劃痕實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)NCIH446細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后的增殖能力、侵襲能力、遷移

2、能力及細(xì)胞凋亡數(shù)目的改變。同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、Wcsterablot方法，檢測(cè)人小細(xì)胞肺癌組織、細(xì)胞株、、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁肺組織中ABCEl的表達(dá)情況。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上構(gòu)建可以用于篩選陽(yáng)性克隆且?guī)в芯G色熒光的ABCEl基因SiI悄A表達(dá)載體ABCElpRNATU61／NooSiRNA1、ABCElPRN柞U61／NeoSiRNA2及ABCEIpRNATU61／NeoSiRNAN，采用FUGENEHD法將載體ABCElpRNADU61

3、／NeoSiRNA1、ABCElPRNATU61／NeoSiRNA2及ABCElpRNATU61／NcoSiRNAN轉(zhuǎn)染ANCIH446細(xì)胞中，并以(3418(400pg／m1)進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，篩選ABCEl基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。幺七蟹三日禾經(jīng)酶切和研蛆測(cè)序驗(yàn)證，證實(shí)pEGFPABCEI、ABCElSiRNA及ABCElpRNATU61／NeoSiRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。免疫組織化學(xué)法、Westernblot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：小細(xì)胞肺

4、癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ABCEI的表達(dá)水平明顯高于癌旁肺組織，差異具有顯著性。小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株同樣顯示ABCEl的高表達(dá)。轉(zhuǎn)染ABCElSiRNA后的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)紅色熒光。在轉(zhuǎn)染ABCElSiRNAN的NCIH446細(xì)胞中其ABCEI基因呈高表達(dá)，而轉(zhuǎn)染ABCElSiRNA1、ABCElSiRNA2的細(xì)胞呈低表達(dá)，故確認(rèn)目的載體ABCElSiRNA1、ABCElSiRNA2已成功轉(zhuǎn)染至NCIH446細(xì)胞中并起到了一定程度的沉默AB

5、CEl基因的目的。MTT實(shí)驗(yàn)提示，轉(zhuǎn)染ABCElSiRNA1、ABCElSiRNA2的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染ABCElSiRNAN的同類細(xì)胞相比增殖能力受到明顯抑制，轉(zhuǎn)染ABCElSiRNAN后的細(xì)胞增殖程度與對(duì)照組細(xì)胞則無(wú)明顯改變。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ABCElSiRNA1、ABCElSiRNA2后的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染ABCElSiRNAN組細(xì)胞明顯減少，而轉(zhuǎn)染ABCElSiRNAN后的穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組