TC-1(c8orf4)在非小細胞肺癌增殖、遷移和侵襲中作用的研究.pdf

1、目的：
　　肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率高居首位的惡性腫瘤。轉(zhuǎn)移是導致肺癌病人預后不良的主要原因。業(yè)已證實,TC-1(c8orf4)在多種腫瘤組織中較正常組織表達異常增高,并同腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是,其在肺癌中的作用尚不明確。本課題旨在研究TC-1在非小細胞肺癌增殖、遷移和侵襲中的作用及其可能機制,為肺癌防治提供新靶點,開辟新思路。
　　方法：
　　1.收集147例臨床非小細胞肺癌(NSCLC)病人癌組織、配對正常

2、肺組織標本,以及臨床病理信息。采用免疫組化的方法檢測TC-1在肺癌組織以及正常肺組織中的表達,并分析二者之間TC-1的表達差異,及其與年齡、性別、病理類型、臨床TNM分期以及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　2.體外構(gòu)建pLenti-TC-1,pLenti-TC-1si,pLenti-E慢病毒表達載體;轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞系;建立穩(wěn)定的TC-1過表達(A549-TC-1(+))、低表達(A549-TC-1(-))及對照空病毒轉(zhuǎn)染(A5

3、49-control)A549細胞系克隆。分別采用MTT實驗檢測TC-1對A549細胞增殖能力的影響,劃痕實驗檢測TC-1對A549細胞遷移能力的影響, Matrigel侵襲實驗檢測TC-1對A549細胞侵襲能力的影響。
　　3.采用realtime PCR及western blot檢測A549-TC-1(+),A549-TC-1(-)以及A549-control三種細胞系Wnt/β-catenin通路基因β-catenin及下游

4、靶基因VEGF, Cyclin D1,MMP-7,c-Myc和 survivin在mRNA和蛋白水平的表達,探討TC-1對A549細胞增殖、遷移和侵襲影響的可能機制
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化檢測結(jié)果顯示:TC-1在肺癌組織中表達于染色陽性細胞胞漿內(nèi),多呈彌漫性分布,其總體陽性率為65.99％(97/147); TC-1表達在不同性別、年齡以及病理類型之間無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05),但與TNM分期以及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密

5、切相關(guān)(P<0.01)。在TNM分期中,Ia/b期患者TC-1的陽性率為58.00%(29/50), IIa/b期病人中的陽性率為63.16%(24/38),IIIa/b期病人中的陽性率為74.58%(44/59)。TC-1在N0病人中的陽性率為59.38%(38/64),在N1的病人中的陽性率為60.60%(20/33),在 N2的病人中的陽性率為78.00%(39/50)。實驗結(jié)果提示:TC-1在非小細胞肺癌中的表達與性別、年齡、病

6、理類型無關(guān),但是與臨床TNM分期以及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況存在正相關(guān)性。
　　2.分別采用realtime-PCR以及Western blot檢測篩選建立的A549-TC-1(+)、A549-TC-1(-)及A549-control細胞系,結(jié)果顯示:克隆A549-TC-1(+)細胞系在mRNA及蛋白水平穩(wěn)定高表達TC-1;克隆A549-TC-1(-)細胞系在TC-1表達量明顯降低;克隆A549-control細胞系TC-1表達量與普通

7、A549細胞系無明顯不同。為了保證后續(xù)實驗的嚴謹性以及可重復性,我們選擇這三個克隆進行功能性實驗。采用MTT實驗檢測TC-1對A549細胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示:A549-TC-1(+)細胞增殖明顯快于A549-control,而A549-TC-1(-)細胞增殖最慢,各組之間具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)。表明:在肺癌A549細胞中,TC-1能夠促進肺癌細胞增殖。采用劃痕實驗檢測 TC-1對 A549細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示:

8、A549-TC-1(+)細胞遷移速度最快,而A549-TC-1(-)細胞遷移速度最慢。表明:在肺癌A549細胞中,TC-1能夠促進肺癌細胞遷移。采用Matrigel侵襲實驗檢測TC-1對A549細胞侵襲能力的影響,結(jié)果提示:TC-1能夠增強肺癌A549細胞侵襲能力。
　　3.分別采用 realtime-PCR及 western blot檢測 Wnt/β-catenin通路基因在A549-TC-1(+),A549-TC-1(-)以及

9、A549-control三種細胞系中的表達差異。結(jié)果顯示,β-catenin基因及Wnt/β-catenin通路下游靶基因VEGF,Cyclin D1,MMP-7, c-Myc和survivin在mRNA和蛋白水平表達均存在差異,以A549-TC-1(+)細胞系為最高,A549-TC-1(-)細胞系為最低。表明:TC-1能夠調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路。
　　結(jié)論：
　　1.TC-1在非小細胞肺癌中高表達,與臨床TNM

10、分期以及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),而同年齡、性別、病理類型不相關(guān)。
　　2.成功構(gòu)建 TC-1穩(wěn)定過表達、低表達的A549細胞系(A549-TC-1(+))、(A549-TC-1(-))及對照空病毒轉(zhuǎn)染的A549細胞系(A549-control)。經(jīng)MTT實驗、劃痕實驗、Matrigel侵襲實驗證實:TC-1能夠促進肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲。
　　3.肺癌A549細胞中過表達TC-1,能夠增加Wnt/β-catenin

11、信號通路中調(diào)節(jié)基因β-catenin及下游靶基因VEGF,Cyclin D1, MMP-7,c-Myc和 survivin的mRNA及蛋白水平表達;而低表達TC-1蛋白的肺癌A549細胞則出現(xiàn)β-catenin,VEGF, Cyclin D1,MMP-7,c-Myc和survivin mRNA及蛋白表達降低。表明:TC-1能夠調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路。
　　本實驗系統(tǒng)地研究了TC-1在非小細胞肺癌中的表達,在肺癌A549