TC-1在肺癌組織中的表達(dá)和甲基化的意義研究.pdf

1、目的:
　　TC-1(thyroid cancer-1)是近年發(fā)現(xiàn)的由C8orf4基因編碼的核蛋白，它首先被發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)，研究證實(shí)TC-1蛋白COOH端三個(gè)區(qū)域易形成緊密的螺旋結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其與目的蛋白結(jié)合，調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。已有研究證實(shí)，TC-1作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路上游調(diào)節(jié)基因與β-catenin競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cby(Chibby)，減輕cby對(duì)下游靶基因-如cyclinD1，MM

2、P-7，MMP-14，CD44，c-Met等的抑制作用，從而間接的增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　但是，TC-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與臨床病理因素及β-catenin的關(guān)系尚不明確，肺癌組織中TC-1的甲基化水平也未有研究。為了明確以上問(wèn)題，我們檢測(cè)了NSCLC中TC-1的表達(dá)情況，分析了TC-1表達(dá)與臨床病理因素及β-catenin水平的關(guān)系，并進(jìn)一步探討了TC-1的甲基化

3、水平與肺癌的惡性表型的關(guān)系。
　　方法:
　　1、組織標(biāo)本來(lái)源
　　在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行。100例肺癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤5cm)來(lái)自2008-2010年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)的病人，組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋?；颊咝g(shù)前均未接受放化療，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。組織學(xué)診斷和分化程度根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。
　　2、免疫組織化學(xué)染色
　　組織經(jīng)10

4、％中性福爾馬林固定，石蠟包埋。將石蠟包埋的肺癌組織塊切成4μm厚切片。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。使用即用SP超敏免疫組化試劑盒（邁新，福州，中國(guó)）。兔抗人TC-1(1∶200)或鼠抗人β-catenin(1∶200)。兩位病理醫(yī)生對(duì)切片分別作出判定，每張組織切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，陽(yáng)性率根據(jù)陽(yáng)性癌細(xì)胞所占百分比計(jì)算。TC-1和β-catenin表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，也可在細(xì)胞核中表達(dá)。每個(gè)病例

5、的TC-1或β-catenin的陽(yáng)性率1％-25％為1分、＞25％-50％為2分、50％-75％為3分、76％-100％為4分，染色強(qiáng)度分為0分（無(wú)著色）、1分（黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）。陽(yáng)性率與強(qiáng)度評(píng)分相乘:≤6分為低表達(dá)，≥8分為高表達(dá)。當(dāng)＞10％的癌細(xì)胞胞核染色陽(yáng)性時(shí)則該病例定義為核表達(dá)陽(yáng)性。
　　3、DNA提取與亞硫酸鹽處理后測(cè)序(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)
　　按照北京

6、白太克公司的組織/細(xì)胞DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。準(zhǔn)確定量后，按照EZ DNA甲基化試劑盒(ZYMO)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA樣品甲基化修飾處理，獲得DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR及測(cè)序。
　　4、統(tǒng)計(jì)分析
　　各組資料利用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、TC-1蛋白表達(dá)的臨床意義。
　　TC-1在肺鱗癌和腺癌組織中表達(dá)明顯增加，其胞質(zhì)表達(dá)與肺癌的組織學(xué)類型(P＜0.0

7、01)、分化程度(P=0.028)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)顯著相關(guān)，其胞核表達(dá)與肺癌的分化程度相關(guān)，P=0.017。β-catenin在肺鱗癌和腺癌組織中的表達(dá)亦明顯增加，其胞質(zhì)表達(dá)與肺癌的組織學(xué)類型(P=0.001)、分化程度(P=0.009)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.013）有顯著關(guān)聯(lián)性，而其在胞核表達(dá)未見(jiàn)明顯關(guān)聯(lián)性。TC-1的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)與β-catenin的胞質(zhì)表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P＜0.001)，TC-1在肺癌中的細(xì)胞核表達(dá)也與

8、β-catenin的細(xì)胞核表達(dá)正相關(guān)(P=0.003)。
　　2、TC-1的甲基化水平與肺癌的惡性表型的關(guān)系。
　　BSP結(jié)果顯示在肺癌和癌旁正常肺組織中，94和105位點(diǎn)均為甲基化狀態(tài)，肺癌組織中，第49bp位點(diǎn)CpG的甲基化明顯低于癌旁正常肺組織(P=0.045)，其他位點(diǎn)未見(jiàn)明確相關(guān)性，肺癌組織中，第13位點(diǎn)的去甲基化與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.014），第41位點(diǎn)也有相似的趨勢(shì)，其他位點(diǎn)未見(jiàn)明確相關(guān)性