在HepG2細(xì)胞與HMCs細(xì)胞中探討炎癥因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響.pdf

1、第一部分肝X受體α啟動(dòng)子蟲螢光素酶質(zhì)粒的構(gòu)建
　　目的:本部分旨在構(gòu)建人類肝X受體α啟動(dòng)子的蟲熒光素酶重組質(zhì)粒。
　　方法:以HepG2細(xì)胞DNA為模板擴(kuò)增肝X受體α啟動(dòng)子序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后與同樣雙酶切的pGL3-Basic載體進(jìn)行連接并進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及測(cè)序分析證明成功構(gòu)建了LXRα啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pGL3-Basic-LXRα-P）。
　　結(jié)論:利用

2、已知的啟動(dòng)子序列結(jié)合生物信息學(xué)資源能準(zhǔn)確快速的構(gòu)建出啟動(dòng)子蟲熒光素酶重組質(zhì)粒。
　　第二部分在HepG2細(xì)胞中探討炎癥因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響
　　目的:在HepG2細(xì)胞中觀察炎癥因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響，從而探討HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚的分子機(jī)制。
　　方法:將構(gòu)建的LⅪRα基因啟動(dòng)子的蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶報(bào)告基因載體pRL-TK作內(nèi)參照，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系

3、統(tǒng)檢測(cè)炎癥因子對(duì)LXRα啟動(dòng)子活性的影響，進(jìn)一步將HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組(control)、炎癥組(TNFα20ng/ml)、高脂組(LDL，100ug/ml)及聯(lián)合處理組(TNFα20ng/ml+LDL100ug/ml)。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Westem Blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞中LXRα、ABCG1、ABCA1基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。用油紅O染色和定量比色法分析HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。
　　結(jié)果:炎癥因子能明顯

4、抑制LXRα啟動(dòng)子的活性。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，炎癥因子下調(diào)了LXRα、ABCA1、ABCG1 mRNA與蛋白表達(dá)。油紅O染色和定量結(jié)果顯示，炎癥因子使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增加。
　　結(jié)論:炎癥因子可能通過(guò)抑制LXRα啟動(dòng)子活性，干擾LXRα受體途徑從而抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常積聚。
　　第三部分在HMCs細(xì)胞中探討炎癥因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響
　　目的:在HMCs細(xì)胞中觀察炎癥

5、因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響，從而探討HMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚的分子機(jī)制。
　　方法:將構(gòu)建的LXRα啟動(dòng)子的蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與海腎熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至HMCs中，采用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)觀察炎癥因子對(duì)LXRα啟動(dòng)子活性的影響，進(jìn)一步將HMCs細(xì)胞分為對(duì)照組(control)、炎癥組（TNFα20ng/ml）、高脂組(LDL，100ug/ml)及聯(lián)合處理組(TNFα20ng/ml+LDL100ug/ml)。采用實(shí)時(shí)

6、定量PCR和Western Blot檢測(cè)HMCs細(xì)胞中LXRα、ABCA1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。用油紅O染色和定量比色法分析HMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。
　　結(jié)果:炎癥因子能明顯抑制LXRα啟動(dòng)子的活性。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，炎癥因子下調(diào)了LXRα與ABCA1mRNA與蛋白表達(dá)。油紅O染色和定量結(jié)果顯示，炎癥因子使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增加。
　　結(jié)論:炎癥因子可能通過(guò)抑制LXRα啟動(dòng)子活性，干擾LXRα受體途徑從而抑