輻射誘導HepG2細胞IER5表達與CDC25B的相互作用.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌(Primary hepaatocellular carcinoma，PHC)是惡性程度比較高的消化道腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發(fā)病率居第五位，而死亡率在消化道惡性腫瘤中居第三位。目前原發(fā)性肝癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放射治療、介入治療、射頻消融術(shù)等方法，而手術(shù)治療面臨無法完全切除、術(shù)后復發(fā)率高、創(chuàng)傷大等問題，近年來隨著三維適型放療及調(diào)強放療技術(shù)的發(fā)展，放射治療已經(jīng)成為肝癌治療的有效手段。
　　 細胞周期

2、是指細胞從第一次有絲分裂結(jié)束至下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，分為細胞間期和分裂期。細胞間期又分為G1期、S期與G2期。細胞分裂期（M期），包括前期、中期、后期和末期（G0期），細胞周期從G1→S→G2→M期存在G1/S、G2/M兩個檢定點，某些突發(fā)事件引發(fā)的細胞反應使細胞周期停滯在檢定點，稱為細胞周期阻滯(Cell cycle arrest)。
　　 CDC25家族是細胞周期調(diào)控的重要因子，CDC25家族蛋白通過調(diào)控CDKs的

3、活性來精確調(diào)控細胞周期。CDC25家族包括3種同源異構(gòu)體(CDC25A、CDC25B、CDC25C)，CDC25家族是一組蘇/酪氨酸雙功能酶，其在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮著巨大的作用。CDC25B基因位于人類染色體20p13，研究已經(jīng)證實，CDC25B過表達可以增加腫瘤細胞的生長，相反抑制CDC25B的表達可以抑制腫瘤細胞的生長，其作用機制是CDC25B可能使腫瘤細胞阻滯在s期或更早，但具體作用機制仍不是特別清楚，有待進一步的研究。CDC25

4、B在細胞周期起著監(jiān)測點的作用，其在傳導通路中處于最終的靶蛋白地位，作為很多通路的最終效應蛋白。目前有人發(fā)現(xiàn)CDC25B在胎鼠肝臟中過量表達，提示可能與胚胎發(fā)育相關，其在生長發(fā)育中起到一定作用。目前對于CDC25B的作用機制仍不十分清楚，有待進一步研究。
　　 IER5屬于早期慢反應基因家族，是Immediate early response 5的簡稱，人的該基因位于染色體上1q25.3，Williams等人通過實驗證實IER5是

5、一種富含脯氨酸且具有多個核酸位點的蛋白，IER5通過磷酸化和（或）去磷酸化作用對外界刺激有快速調(diào)節(jié)作用，這暗示IER5可能對細胞有絲分裂發(fā)揮重要作用。我們的前期研究已經(jīng)證實輻射可誘導IER5轉(zhuǎn)錄水平升高，在輻射誘導細胞凋亡中發(fā)揮一定作用。我們前期對AHH1，Hela以及HepG2細胞的研究顯示，抑制IER5基因的表達HepG2細胞進入S期的細胞比例增加;增加IER5基因表達HepG2細胞進入S期的比例減少，IER5可以使細胞發(fā)生細胞阻滯

6、，誘導細胞凋亡。目前一些學者研究發(fā)現(xiàn)在慢性粒細胞白血病細胞中誘導IER5蛋白表達增加，CDC25BmRNA表達隨之降低，提示IER5與CDC25B可能存在相互作用，我們推測IER5基因可能通過抑制CDC25B表達參與了細胞周期的調(diào)控，本研究旨在探討輻射誘導HepG2細胞IER5及CDC25BmRNA表達變化情況，以及HepG2細胞IER5表達與CDC25B的相互作用。
　　 鑒于國內(nèi)外尚乏有關肝癌IER5基因表達與CDC25B關

7、系的研究報道，更未見有關輻射誘導HepG2細胞IER5蛋白表達與CDC25B關系的研究報道。因此，本研究擬采用瞬時轉(zhuǎn)染建立IER5低表達HepG2細胞系、采用脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立IER5基因高表達HepG2細胞系（前期研究已構(gòu)建成功），通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)及染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)等方法研究在HepG2細胞中，輻射

8、誘導IER5及CDC25BmRNA在細胞周期中的相互作用，IER5蛋白是否通過競爭性結(jié)合CDC25B啟動子DNA結(jié)合位點參與了細胞周期調(diào)控。
　　 方法:①采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)建立IER5低表達HepG2細胞系:用脂質(zhì)體2000作為載體，將前期構(gòu)建的IER5低表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至HepG2細胞內(nèi)，同時以轉(zhuǎn)染空載體的細胞作為對照組。②采用脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立IER5基因高表達細胞系（命名為HepG2/IER5細胞，前期研究已構(gòu)建成

9、功）。③2Gy、4Gy60Co-γ射線照射過表達、低表達及對照組HepG2細胞，采用RT-PCR檢測IER5mRNA及CDC25BmRNA含量;通過染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）分析IER5蛋白與CDC25B啟動子DNA的相互作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、2Gy、4Gy60Co-γ射線照射后，HepG2細胞IER5及CDC25BmRNA表達的變化:與未照射組(0Gy)相比，照射組HepG2細胞IER5mRNA隨著照射后時

10、間的延長表達先上升后下降，6小時表達量最高;與之相反，CDC25BmRNA的含量先下降后上升，6小時達到最低。且4Gy60Co-γ射線照射組較2Gy照射組IER5mRNA表達增加更明顯，CDC25BmRNA含量下降更明顯，提示IER5與CDC25B可能存在相互拮抗作用。
　　 2、2Gy、4Gy60Co-γ射線照射后，HepG2/IER5細胞IER5及CDC25BmRNA表達的變化:60Co-γ射線照射后，HepG2/IER5細

11、胞與HepG2細胞IER5mRNA變化趨勢一致，但含量增加更明顯;與此同時，HepG2/IER5細胞CDC25BmRNA含量與HepG2細胞變化趨勢一致，且含量下降更明顯，增加IER5表達，輻射抑制CDC25BmRNA表達的作用增強，進一步證實IER5與CDC25B可能存在相互拮抗作用。
　　 3、2Gy、4Gy60Co-γ射線照射后，IER5低表達HepG2細胞IER5及CDC25BmRNA表達的變化:60Co-γ射線照射后，

12、與HepG2細胞相比，IER5低表達HepG2細胞IER5mRNA及CDC25BmRNA含量無明顯變化，說明抑制IER5表達，60Co-γ射線照射失去了對CDC25B表達的抑制作用，再次佐證了IER5與CDC25B間存在相互拮抗作用。
　　 4、染色質(zhì)免疫共沉淀分析研究顯示:輻射誘導HepG2細胞IER5mRNA表達增加，IER5蛋白可競爭性的結(jié)合CDC25B啟動子DNA位點，從而抑制CDC25B的表達，參與了細胞周期的調(diào)控。<