輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞IER5表達(dá)與CDC25B的相互作用.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌(Primary hepaatocellular carcinoma，PHC)是惡性程度比較高的消化道腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發(fā)病率居第五位，而死亡率在消化道惡性腫瘤中居第三位。目前原發(fā)性肝癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放射治療、介入治療、射頻消融術(shù)等方法，而手術(shù)治療面臨無(wú)法完全切除、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、創(chuàng)傷大等問(wèn)題，近年來(lái)隨著三維適型放療及調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)的發(fā)展，放射治療已經(jīng)成為肝癌治療的有效手段。
　　 細(xì)胞周期

2、是指細(xì)胞從第一次有絲分裂結(jié)束至下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程，分為細(xì)胞間期和分裂期。細(xì)胞間期又分為G1期、S期與G2期。細(xì)胞分裂期（M期），包括前期、中期、后期和末期（G0期），細(xì)胞周期從G1→S→G2→M期存在G1/S、G2/M兩個(gè)檢定點(diǎn)，某些突發(fā)事件引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)使細(xì)胞周期停滯在檢定點(diǎn)，稱為細(xì)胞周期阻滯(Cell cycle arrest)。
　　 CDC25家族是細(xì)胞周期調(diào)控的重要因子，CDC25家族蛋白通過(guò)調(diào)控CDKs的

3、活性來(lái)精確調(diào)控細(xì)胞周期。CDC25家族包括3種同源異構(gòu)體(CDC25A、CDC25B、CDC25C)，CDC25家族是一組蘇/酪氨酸雙功能酶，其在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著巨大的作用。CDC25B基因位于人類染色體20p13，研究已經(jīng)證實(shí)，CDC25B過(guò)表達(dá)可以增加腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，相反抑制CDC25B的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制是CDC25B可能使腫瘤細(xì)胞阻滯在s期或更早，但具體作用機(jī)制仍不是特別清楚，有待進(jìn)一步的研究。CDC25

4、B在細(xì)胞周期起著監(jiān)測(cè)點(diǎn)的作用，其在傳導(dǎo)通路中處于最終的靶蛋白地位，作為很多通路的最終效應(yīng)蛋白。目前有人發(fā)現(xiàn)CDC25B在胎鼠肝臟中過(guò)量表達(dá)，提示可能與胚胎發(fā)育相關(guān)，其在生長(zhǎng)發(fā)育中起到一定作用。目前對(duì)于CDC25B的作用機(jī)制仍不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。
　　 IER5屬于早期慢反應(yīng)基因家族，是Immediate early response 5的簡(jiǎn)稱，人的該基因位于染色體上1q25.3，Williams等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)IER5是

5、一種富含脯氨酸且具有多個(gè)核酸位點(diǎn)的蛋白，IER5通過(guò)磷酸化和（或）去磷酸化作用對(duì)外界刺激有快速調(diào)節(jié)作用，這暗示IER5可能對(duì)細(xì)胞有絲分裂發(fā)揮重要作用。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)輻射可誘導(dǎo)IER5轉(zhuǎn)錄水平升高，在輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮一定作用。我們前期對(duì)AHH1，Hela以及HepG2細(xì)胞的研究顯示，抑制IER5基因的表達(dá)HepG2細(xì)胞進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加;增加IER5基因表達(dá)HepG2細(xì)胞進(jìn)入S期的比例減少，IER5可以使細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞阻滯

6、，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)IER5蛋白表達(dá)增加，CDC25BmRNA表達(dá)隨之降低，提示IER5與CDC25B可能存在相互作用，我們推測(cè)IER5基因可能通過(guò)抑制CDC25B表達(dá)參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，本研究旨在探討輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞IER5及CDC25BmRNA表達(dá)變化情況，以及HepG2細(xì)胞IER5表達(dá)與CDC25B的相互作用。
　　 鑒于國(guó)內(nèi)外尚乏有關(guān)肝癌IER5基因表達(dá)與CDC25B關(guān)

7、系的研究報(bào)道，更未見(jiàn)有關(guān)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞IER5蛋白表達(dá)與CDC25B關(guān)系的研究報(bào)道。因此，本研究擬采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染建立IER5低表達(dá)HepG2細(xì)胞系、采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立IER5基因高表達(dá)HepG2細(xì)胞系（前期研究已構(gòu)建成功），通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)及染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)等方法研究在HepG2細(xì)胞中，輻射

8、誘導(dǎo)IER5及CDC25BmRNA在細(xì)胞周期中的相互作用，IER5蛋白是否通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDC25B啟動(dòng)子DNA結(jié)合位點(diǎn)參與了細(xì)胞周期調(diào)控。
　　 方法:①采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)建立IER5低表達(dá)HepG2細(xì)胞系:用脂質(zhì)體2000作為載體，將前期構(gòu)建的IER5低表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)以轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為對(duì)照組。②采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立IER5基因高表達(dá)細(xì)胞系（命名為HepG2/IER5細(xì)胞，前期研究已構(gòu)建成

9、功）。③2Gy、4Gy60Co-γ射線照射過(guò)表達(dá)、低表達(dá)及對(duì)照組HepG2細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)IER5mRNA及CDC25BmRNA含量;通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）分析IER5蛋白與CDC25B啟動(dòng)子DNA的相互作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、2Gy、4Gy60Co-γ射線照射后，HepG2細(xì)胞IER5及CDC25BmRNA表達(dá)的變化:與未照射組(0Gy)相比，照射組HepG2細(xì)胞IER5mRNA隨著照射后時(shí)

10、間的延長(zhǎng)表達(dá)先上升后下降，6小時(shí)表達(dá)量最高;與之相反，CDC25BmRNA的含量先下降后上升，6小時(shí)達(dá)到最低。且4Gy60Co-γ射線照射組較2Gy照射組IER5mRNA表達(dá)增加更明顯，CDC25BmRNA含量下降更明顯，提示IER5與CDC25B可能存在相互拮抗作用。
　　 2、2Gy、4Gy60Co-γ射線照射后，HepG2/IER5細(xì)胞IER5及CDC25BmRNA表達(dá)的變化:60Co-γ射線照射后，HepG2/IER5細(xì)

11、胞與HepG2細(xì)胞IER5mRNA變化趨勢(shì)一致，但含量增加更明顯;與此同時(shí)，HepG2/IER5細(xì)胞CDC25BmRNA含量與HepG2細(xì)胞變化趨勢(shì)一致，且含量下降更明顯，增加IER5表達(dá)，輻射抑制CDC25BmRNA表達(dá)的作用增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)IER5與CDC25B可能存在相互拮抗作用。
　　 3、2Gy、4Gy60Co-γ射線照射后，IER5低表達(dá)HepG2細(xì)胞IER5及CDC25BmRNA表達(dá)的變化:60Co-γ射線照射后，

12、與HepG2細(xì)胞相比，IER5低表達(dá)HepG2細(xì)胞IER5mRNA及CDC25BmRNA含量無(wú)明顯變化，說(shuō)明抑制IER5表達(dá)，60Co-γ射線照射失去了對(duì)CDC25B表達(dá)的抑制作用，再次佐證了IER5與CDC25B間存在相互拮抗作用。
　　 4、染色質(zhì)免疫共沉淀分析研究顯示:輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞IER5mRNA表達(dá)增加，IER5蛋白可競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合CDC25B啟動(dòng)子DNA位點(diǎn)，從而抑制CDC25B的表達(dá)，參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。<