肝癌組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的鑒定及其藥物干預(yù).pdf

1、肝細(xì)胞癌(以下稱(chēng)肝癌，hepatocellular carcinoma，HCC)是中國(guó)第二和世界第三大腫瘤相關(guān)死亡的病因[1，2]。盡管外科手術(shù)和肝移植為肝癌提供了有效的治療措施，但肝癌根治性切除術(shù)后的5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)54.1-61.5％，其中62.4-77.8％發(fā)生在術(shù)后兩年以?xún)?nèi)，這些導(dǎo)致了肝癌患者的預(yù)后仍然很差[3]。人們一直以來(lái)都認(rèn)為肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移主要和腫瘤細(xì)胞本身的生物學(xué)特性有關(guān)。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞并不是孤立存在，而是處

2、在一個(gè)包括炎癥免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子等共同組成的復(fù)雜環(huán)境之中，這種微觀環(huán)境被稱(chēng)為“腫瘤微環(huán)境”[4]。“炎癥破壞-組織修復(fù)”的惡性循環(huán)促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[5]。臨床上大部分肝癌患者有乙型或(和)丙型肝炎肝硬化背景。炎癥和肝硬化導(dǎo)致的細(xì)胞增殖異?？梢源龠M(jìn)腫瘤的演進(jìn)和進(jìn)展[6]。因此，腫瘤的免疫微環(huán)境在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated

3、macrophages，TAMs)是活躍于腫瘤為環(huán)境中的炎癥細(xì)胞的重要成分。它們的主要特點(diǎn)是誘導(dǎo)宿主免疫抑制，刺激血管生成，分泌腫瘤生長(zhǎng)因子和誘導(dǎo)Ⅱ型炎癥反應(yīng)[7]。TAMs被認(rèn)為是替代途徑激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages，AAMs)或M2型巨噬細(xì)胞亞型[8]。以前的研究多利用泛巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(pan-macrophage marker)CD68作為標(biāo)記識(shí)別腫瘤組織中的TAMs[9-

4、11]。由于腫瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞是由多種不同的巨噬細(xì)胞亞群組成，各自在不同的微解剖位置發(fā)揮不同甚至相反的作用。因此尋找更加特異的標(biāo)志物對(duì)于識(shí)別肝癌組織中TAMs并探索其功能具有重要的意義。
　　由于肝癌細(xì)胞本身及肝硬化環(huán)境等原因，至今臨床上對(duì)肝癌治療有效的藥物很少。sorafenib作為酪氨酸激酶受體抑制劑，可以通過(guò)抑制肝癌組織中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor re

5、ceptor，VEGFR)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)阻斷腫瘤血管生成及通過(guò)抑制RAF/MEK/ERK通路直接影響腫瘤的凋亡過(guò)程進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)的多點(diǎn)靶向治療藥物[12]。臨床實(shí)驗(yàn)證明，sorafenib可以使晚期肝癌患者生存期提高3.8個(gè)月[13]。我所(復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所)利用自主建立的人肝癌裸鼠模型篩選藥物發(fā)現(xiàn)α干擾素(Interferon-

6、α，IFN-α)可以有效抑制肝癌的生長(zhǎng)[14]。臨床試驗(yàn)也證實(shí)IFN-α可以有效預(yù)防肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[15]。即便如此，兩種藥物對(duì)肝癌的療效仍不滿意。而且，以上兩種藥物臨床上均出現(xiàn)藥物耐受和副作用[16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明sorafenib治療可能促進(jìn)肝癌組織的血管生成的惡性反彈及腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，此種副作用的出現(xiàn)可能與腫瘤組織中的TAMs的誘導(dǎo)有關(guān)[17]。
　　因此本研究以TAMs為中心，尋找人肝癌組織中TAMs特異性標(biāo)志

7、物闡述其重要性。觀察臨床有效的抗肝癌藥物對(duì)TAMs的影響并分析其機(jī)制。
　　第一部分CD206鑒定肝癌組織中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的可行性研究
　　CD206作為體外實(shí)驗(yàn)中AAMs或M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其在腫瘤組織中的表達(dá)還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。相對(duì)于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，原位觀察人肝癌組織中TAMs的分布及其鑒定具有重要意義。因此本部分利用人肝癌和癌周組織標(biāo)本，分離原代細(xì)胞，直觀反映炎癥CD206+細(xì)胞在肝癌組中的分布，分析CD20

8、6作為特異性標(biāo)志鑒定識(shí)別肝癌組織中TAMs的可行性。
　　收集人肝癌和癌周組織標(biāo)本，制作連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)方法顯示，CD206在肝癌組織和癌周組織的表達(dá)完全不同。在肝癌組織中CD206表達(dá)在腫瘤間質(zhì)的單核巨噬細(xì)胞中并與CD68有共表達(dá)現(xiàn)象，而在癌周其呈管狀表達(dá)，貼附于肝血竇內(nèi)皮內(nèi)壁上與CD68的表達(dá)無(wú)共表達(dá)現(xiàn)象。為進(jìn)一步證實(shí)免疫組化的發(fā)現(xiàn)，我們分離新鮮肝癌組織和癌周組織的CD206+細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver

9、sinusoidalendothelial cells，LSECs)。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)以上各群原代細(xì)胞的CD206和CD68的表達(dá)發(fā)現(xiàn)。癌內(nèi)和癌周CD206+細(xì)胞的CD68中位陽(yáng)性率分別是96.6％和0.32％(范圍，94.5-98.2％和0.16-0.92％)。癌內(nèi)和癌周巨噬細(xì)胞的CD206中位陽(yáng)性率分別是33.8％和0.57％(范圍，0-73.4％和0.12-0.96％)。癌內(nèi)和癌周LSECs的

10、CD206中位陽(yáng)性率分別是0.64％和56.8％(范圍，0.37-0.89％和14.1-87.3％)。綜合免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，經(jīng)邏輯分析，癌內(nèi)CD206+細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的亞群，而癌周CD206+細(xì)胞是LSECs的亞群。為進(jìn)一步驗(yàn)證CD206+巨噬細(xì)胞的真實(shí)身份，我們將分離的原代細(xì)胞體外培養(yǎng)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)上清液中的細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，和CD206

11、-巨噬細(xì)胞相比，CD206+巨噬細(xì)胞分泌更高水平的M2型細(xì)胞因子(IL-10和TGF-β)和更低水平的M1型細(xì)胞因子(1L-β和IL-12)。將原代細(xì)胞與肝癌細(xì)胞系共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，CD206+巨噬細(xì)胞可以提高肝癌細(xì)胞系的移動(dòng)和侵襲能力，而CD206-巨噬細(xì)胞對(duì)其無(wú)明顯影響。
　　因此得出結(jié)論，癌內(nèi)CD206+細(xì)胞是一群表型和功能上接近TAMs的巨噬細(xì)胞亞群，癌周CD206+細(xì)胞則是LSECs的亞群。CD206可以作為特異性標(biāo)志識(shí)別鑒

12、定肝癌組織中的TAMs。另外，我們也揭示之前未被發(fā)現(xiàn)的肝癌組織中巨噬細(xì)胞分布的特點(diǎn)，即TAMs只出現(xiàn)在癌內(nèi)組織中而非癌周組織。
　　第二部分腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與肝癌患者預(yù)后及IFNα療效的關(guān)系
　　在第一部分的基礎(chǔ)上，本部分利用臨床患者的肝癌組織標(biāo)本制作組織芯片，分析以CD206作為標(biāo)志鑒定的巨噬細(xì)胞與肝癌患者根治性切除后的預(yù)后及術(shù)后應(yīng)用IFN-α療效的關(guān)系。
　　首先，我們收集了兩群(訓(xùn)練集(n=323)和驗(yàn)證集(n=

13、401))在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科經(jīng)根治性切除治療的肝癌患者組織標(biāo)本，制作組織芯片，經(jīng)免疫組化CD206和CD68染色，利用圖像分析系統(tǒng)分析CD206在肝癌組中的表達(dá)。免疫組化發(fā)現(xiàn)癌內(nèi)的CD206表達(dá)在單核.巨噬細(xì)胞上與CD68有部分共表達(dá)現(xiàn)象，而癌周CD206主要表達(dá)在肝血竇內(nèi)壁。這和第一部分的觀察結(jié)果一致。之后，我們分析了CD206+細(xì)胞和患者預(yù)后的關(guān)系。驗(yàn)證集中，癌內(nèi)CD68+細(xì)胞的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后無(wú)關(guān)。癌周CD68+細(xì)胞

14、與患者總體生存時(shí)間(overall survival，OS)和無(wú)瘤生存時(shí)間(disease-free survival，DFS)均呈負(fù)性相關(guān)。CD206+細(xì)胞的表達(dá)和患者的OS(癌內(nèi)，風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)(HR)=2.790，P<.001：癌周，HR=1.774，P=.001)與DFS(癌內(nèi)，HR=1.621，P=.003；癌周，HR=2.693，P<.001)呈負(fù)性相關(guān)，兩者聯(lián)合后可獲得更顯著的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值(OS，HR=3.745，P<.001：

15、DFS，HR=3.061，P<.001)。驗(yàn)證集中此結(jié)果得到證實(shí)。
　　之后，我們收集了術(shù)后IFN-α治療隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)中治療組和對(duì)照組肝癌患者組織標(biāo)本(治療集)，制作組織芯片。免疫組化CD206染色，分析與IFN-α術(shù)后治療后肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，治療組中，癌內(nèi)CD206+細(xì)胞高表達(dá)者OS和DFS均高于癌內(nèi)CD206+細(xì)胞低表達(dá)者。對(duì)照組中，癌內(nèi)CD206+細(xì)胞高表達(dá)者OS和DFS均低于癌內(nèi)CD206+細(xì)胞低表達(dá)者。治

16、療組中的癌內(nèi)CD206+細(xì)胞高表達(dá)者OS和DFS均高于對(duì)照組中癌內(nèi)CD206+細(xì)胞高表達(dá)者。
　　經(jīng)與臨床病理資料比較和生存分析，癌內(nèi)CD206+細(xì)胞與患者預(yù)后有關(guān)，而癌內(nèi)CD68+細(xì)胞與患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性。因此，從臨床意義的角度，癌內(nèi)CD206+細(xì)胞也更接近TAMs。癌周CD206+細(xì)胞高表達(dá)患者經(jīng)IFN-α治療后OS和DFS均得到延長(zhǎng)，提示癌內(nèi)CD206+細(xì)胞可能是IFN-α治療肝癌的重要靶點(diǎn)之一。
　　第三部分 IFNα

17、通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞HSP27的表達(dá)抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)
　　本所的研究證實(shí)，在高肝轉(zhuǎn)移肝癌裸鼠模型中，IFNα可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。初步的研究發(fā)現(xiàn)，其抗腫瘤作用可能通過(guò)抑制血管生成。但具體機(jī)制還不明確。
　　我們收集經(jīng)IFNα治療和對(duì)照組的高轉(zhuǎn)移肝癌裸鼠模型的組織標(biāo)本，提取RNA，進(jìn)行RT2 ProfilerTM PCR基因芯片分析后發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，IFNα治療組中熱休克蛋白27(heat shock prote

18、in27，HSP27)下調(diào)(P<.001)。為了尋找HSP27下調(diào)的原因，我們利用IFNα干預(yù)高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株，收集后提取蛋白和RNA，進(jìn)行Western Blot與PCR驗(yàn)證，但我們發(fā)現(xiàn)，治療組和對(duì)照組HSP27在RNA水平無(wú)顯著性差異。因此我們推測(cè)，HSP下調(diào)的原因可能來(lái)源于腫瘤間質(zhì)。近期有文獻(xiàn)報(bào)道，HSP27可以促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。因此，我們檢測(cè)了經(jīng)IFN-α干預(yù)的人單核細(xì)胞系THP-1誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞表型的變化及HSP