水蛭素對(duì)毒瘀損絡(luò)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭。ALI一般先有激發(fā)事件如直接損傷(肺炎，誤吸異物、毒物，溺水，肺挫傷)或間接損傷(膿毒癥，燒傷，胰腺炎，婦科損傷，大輸血)。ALI的精確發(fā)生率尚有爭論，但仍然是出院患者發(fā)病的主要肺內(nèi)外因素之一。ALI嚴(yán)重威脅人類的健康，影響患者的生存質(zhì)量，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題之一。隨著絡(luò)病學(xué)理論的不斷進(jìn)展和急性肺損傷病理機(jī)制的深入

2、研究，為“毒瘀損絡(luò)”病機(jī)假說提供了現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)。膿毒癥、肺炎、創(chuàng)傷、休克為ALI發(fā)病的四大主要因素，其實(shí)質(zhì)是中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear neutrophil，PMN)等炎癥細(xì)胞及其釋放的炎癥遞質(zhì)介導(dǎo)的失控的炎性反應(yīng)，從而引起肺血管內(nèi)皮損傷、通透性增加和微血栓形成。失控的炎癥反應(yīng)是ALI的基本病理生理機(jī)制。中性粒細(xì)胞是ALI發(fā)病過程中的重要的效應(yīng)細(xì)胞，也是其最終執(zhí)行者。大量中性粒細(xì)胞肺內(nèi)募集(recruitment)

3、、扣押(sequestration)、遷移(transmigration)和浸潤(infiltration)的聚集過程是ALI的病理組織學(xué)特征。目前認(rèn)為，過度、失控的炎癥反應(yīng)是各種病因所致急性肺損傷的根本原因，其中絕大部分表現(xiàn)為PMN依賴性，PMN聚集和激活是引起肺部毛細(xì)血管和肺泡損害的主要原因。而在血管活性因子(LPS、凝血酶、TNF-α等)的作用下，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，血管內(nèi)皮屏障通透性的升高，是PMN等炎癥細(xì)胞從血液到達(dá)血管外肺

4、組織，在肺組織觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？梢?，絡(luò)脈受損、“開門揖盜”是ALI/ARDS發(fā)病的必要前提。ALI動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都提示，Rho/ROCK(Rho kinase)途徑和MLCK(myosinlight chain kinases)途徑對(duì)于PMN肺內(nèi)聚集時(shí)的重要性，主要體現(xiàn)在促進(jìn)血管內(nèi)皮屏障通透性增高和PMN跨血管內(nèi)皮浸潤。
　　 水蛭應(yīng)用于中醫(yī)臨床已有兩千多年的歷史，具有廣泛的藥理作用和醫(yī)療用途，用于破血通經(jīng)，逐瘀

5、消癥。水蛭素為其主要有效藥用成分；研究證明水蛭素(hirudin)是目前已知的作用最強(qiáng)的特異性凝血酶抑制劑；水蛭素對(duì)各種血栓病均有效，對(duì)靜脈血栓和彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的療效更佳，并且提示水蛭素可能具有治療ALI的作用，但具體機(jī)制仍未清楚，值得我們進(jìn)一步的深入探討。本研究在參考眾多文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，采用氣道吸入LPS建立小鼠急性肺損傷模型，模型建立前30分鐘，以肝素(heparin)為對(duì)照藥，以“化瘀通絡(luò)”為指導(dǎo)思想使用水蛭素防治急

6、性肺損傷，觀察高、中、低劑量水蛭素在氣道吸入LPS后16h的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 目的：①探討Rho/ROCK途徑和MLCK途徑在ALI及其血管內(nèi)皮屏障損傷發(fā)生發(fā)展中的作用;②闡釋中醫(yī)絡(luò)病學(xué)理論及肺絡(luò)病理生理與ALI發(fā)病之間的關(guān)系，揭示“毒瘀損絡(luò)”ALI病機(jī)假說的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)；③探討“化瘀通絡(luò)”治療早期ALI的可行性及科學(xué)性；④闡明水蛭素治療LPS致ALI的病理生理學(xué)和細(xì)胞分子學(xué)作用機(jī)制，為臨床防治ALI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

7、r>　　 方法：⑴基于中醫(yī)絡(luò)病學(xué)理論與ALI發(fā)病之間的關(guān)系及“毒瘀損絡(luò)”ALI病機(jī)假說，從理論上探討“化瘀通絡(luò)”防治早期ALI的科學(xué)性和可行性，為應(yīng)用水蛭素治療ALI提供理論依據(jù)。⑵利用隨機(jī)數(shù)字表將小鼠分為5組，每組6只：①正常對(duì)照組(A組)；②LPS致肺損傷組(B組)；③LPS+Hirudin高劑量組(C1組)；④LPS+Hirudin中劑量組(C2組)；(5)LPS+Hirudin低劑量組(C3組)。B、C1、C2、C3組小鼠AL

8、I模型制備同前，A組滴入生理鹽水，余組滴入LPS。LPS滴入前30min，LPS組腹腔注射0.5mL的生理鹽水；C1組腹腔注射等容積2000ATU的Hirudin溶液；C2組注射等容積1000ATU的Hirudin溶液；C3組注射等容積500ATU的Hirudin溶液。通過RT-PCR法測(cè)定肺組織ROCKⅡ mRNA和MLCK mRNA的表達(dá)來探討水蛭素防治LPS致急性肺損傷的細(xì)胞分子學(xué)作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴

9、經(jīng)過細(xì)致的理論探討和研究，認(rèn)為急性肺損傷屬于中醫(yī)“絡(luò)病”范疇，并形成了ALI/ARDS“毒瘀損絡(luò)”的病機(jī)假說。本假說認(rèn)為，毒邪煎熬血液，血凝成瘀；毒邪傷絡(luò)，血溢成瘀；毒邪傷津耗陰，陰傷血滯為瘀；毒壅氣機(jī)，血脈凝滯；毒瘀損臟，血行失司；因此毒瘀互化、肺絡(luò)損傷是ALI/ARDS病機(jī)的關(guān)鍵。在治療上宜遵“絡(luò)以通為用”的治療原則，采用以通絡(luò)為主的“化瘀通絡(luò)”治法。
　　 ⑵小鼠癥狀一體征變化滴入LPS后30分鐘起，所有小鼠均出現(xiàn)皮毛枯槁

10、、倒立、無光澤；精神不振，行動(dòng)遲緩，對(duì)刺激反應(yīng)差；惡寒、蜷縮成團(tuán)狀；大便干結(jié)；呼吸急促、嗆咳。多數(shù)小鼠出現(xiàn)紫紺，鼻腔溢出泡沫樣液體。各用藥組癥狀有明顯改善。
　　 ⑶小鼠呼吸頻率B組小鼠呼吸頻率為(375±23)次/分鐘，與A組(234±11)次/分鐘相比，顯著上升(P＜0.01)；C1、C2及D組小鼠呼吸頻率為(288±13)次/分鐘、(290±12)次/分鐘、(302±14)次/分鐘，與B組相比，顯著降低(P＜0.01)，但

11、仍高于A組(P＜0.01);C3組小鼠呼吸頻率為(345±23)次/分鐘，與B組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 ⑷小鼠肺濕/干重比B組小鼠肺濕/干重比為(5.39±0.20)，與A組(3.36±0.11)相比，顯著上升(P＜0.01)；C1、C2及D組小鼠肺濕/干重比為(4.15±0.16)、(4.54±0.15)、(4.49±0.15)，與B組相比，顯著降低(P＜0.01)，但仍高于A組(P＜0.01)；C3組小鼠

12、肺濕/干重比為(5.21±0.21)，與B組比較，差異無顯著性(P＞o.05)。
　　 ⑸肺組織病理學(xué)檢查和肺損傷積分光鏡下(×200倍)觀察發(fā)現(xiàn)：A組小鼠肺組織，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡壁及間質(zhì)內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤；B組肺組織高度水腫、出血嚴(yán)重，肺間質(zhì)增寬，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，肺泡萎陷明顯，各種炎細(xì)胞大量浸潤，部分肺泡完整性被破壞；C1組肺組織輕度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)增厚減輕，肺泡萎陷明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)較完

13、整；C2組肺組織輕度水腫，見炎細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，較B組肺受損程度減輕；C3組肺組織嚴(yán)重水腫，肺間質(zhì)增寬，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)欠完整，且有明顯炎細(xì)胞浸潤；D組肺組織稍有水腫，肺泡腔及間質(zhì)僅見少量紅細(xì)胞及炎細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)較完整。B組小鼠肺損傷積分為(13.33±0.82)，與A組(1.50±0.84)相比，顯著上升(P＜0.01)；C1、C2、C3及D組小鼠肺損傷積分為(6.17±0.75)、(7.50±1.

14、05)、(8.1711.60)、(7.17±0.75)，與B組相比，顯著降低(P＜0.01)，但仍高于A組(P＜0.01)。
　　 ⑹小鼠肺組織MPO B組小鼠肺組織MPO為(5.02±0.68)U/g，與A組(2.00±0.32)U/g相比，顯著上升(P＜0.01)；C1、C2及D組肺組織MPO為(2.95±0.38)U/g、(3.09±0.37)U/g、(3.12±0.37)U/g，與B組相比，顯著降低(P＜0.01)，但仍

15、高于A組(P＜0.01)；C3組小鼠肺組織MPO為(1.15±0.59)U/g，與B組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 ⑺小鼠BALF中PMN含量B組小鼠BALF中PMN含量為(59.5±10.9)％，與A組(10.83±2.6)％相比，顯著升高(P＜0.01)；C1、C2及D組PMN含量為(41.5±8.46)％、(43.8±8.52)％、(42.8±7.62)％，與B組相比，顯著降低(P＜0.05)，但仍高于A組(

16、P＜0.01)；C3組小鼠PMN含量為(51.3±10.1)％，與B組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 ⑻小鼠肺組織ROCKⅡ mRNA的表達(dá)相對(duì)A組小鼠肺組織ROCKⅡmRNA表達(dá)(相對(duì)單位relative unit)，B組與A組相比，顯著上升(P＜0.01)；C1、C2及C3組與B組相比，顯著降低(P＜0.01)，但仍高于A組(P＜0.01)。
　　 ⑼小鼠肺組織MLCK mRNA的表達(dá)相對(duì)A組小鼠肺組織M

17、LCK mRNA表達(dá)(相對(duì)單位relative unit)，B組與A組相比，顯著上升(P＜0.05)；C1與B組相比，顯著降低(P＜0.05)，但仍高于A組(P＜0.05)；C2及C3組與B組相比，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI可激活Rho/ROCK途徑和MLCK途徑，引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的損傷，血管內(nèi)皮屏障通透性增高，PMN等炎癥介質(zhì)聚集肺內(nèi)造成炎癥損傷和肺功能改變；而水蛭素可通過抑制Rh