骨髓間充質(zhì)干細胞旁分泌因子對缺血性腦卒中后星形膠質(zhì)細胞活性及功能的影響.pdf

1、本文分以下幾章進行探討：
　　第一章 BMSCs旁分泌因子對大鼠MCAO模型腦損傷及損傷后星形膠質(zhì)細胞活性和反應性增生的影響
　　目的：觀察BMSCs及BMSC-CM（含旁分泌因子）對MCAO后大鼠腦梗塞面積和神經(jīng)功能恢復的影響，推斷BMSCs旁分泌因子在急性期缺血性腦損傷修復過程中對星形膠質(zhì)細胞活性和反應性增生的作用。
　　方法：構(gòu)建大鼠MCAO模型，在急性期（即栓塞2h，再灌注6h后）應用立體定向注射技術，依組分別

2、向MCAO模型鼠損傷灶注射PBS（Venicle組）、BMSCs（BM組）或BMSC-CM（含旁分泌因子，CM組）對缺血性腦損傷進行實驗性治療。7d后，TTC染色法檢測腦梗塞面積;改良NSS評分評估神經(jīng)功能恢復情況;TUNEL檢測神經(jīng)細胞凋亡，免疫熒光和Western bolt檢測Caspase3和GFAP蛋白表達。
　　結(jié)果：以下各組，組間差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。局灶注射BMSC-CM（BM組）及BMSC-CM（C

3、M組）均能夠有效減少腦梗塞面積，促進神經(jīng)功能恢復，與對照組（Venicle組）比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，且BM組的改善效果比CM組更加明顯(p＜0.05)。另外，BMSC-CM及BMSC-CM均能減少損傷灶神經(jīng)細胞的凋亡(p＜0.05)，抑制凋亡蛋白Caspase3的表達(p＜0.05)，且對星形膠質(zhì)細胞的反應性增生具有明顯抑制作用，顯著減少GFAP的蛋白表達(p＜0.05)。
　　結(jié)論：BMSC-CM（含旁分泌

4、因子）對MCAO模型鼠的干預，與移植的BMSCs具有相似的治療效果，能有效減少腦梗塞面積，促進神經(jīng)功能恢復，并能減少損傷灶神經(jīng)細胞的凋亡和星形膠質(zhì)細胞的增生。提示，移植的BMSCs能通過旁分泌因子發(fā)揮上述療效。
　　第二章 BMSCs旁分泌因子對OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細胞活性及反應性增生的影響及機制探討
　　目的：進一步探討B(tài)MSCs旁分泌因子對缺血性損傷后星形膠質(zhì)細胞凋亡和反應性增生的調(diào)節(jié)作用及其機制。
　　方

5、法：以體外構(gòu)建的缺血性腦卒中模型（OGD模型）為基礎，對損傷后星形膠質(zhì)細胞用全培培養(yǎng)基（單純OGD/再灌注組，Standard組）、BMSC-CM（含旁分泌因子，Conditioned組）或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)（Co-cultured組）進行干預，以誘導星形膠質(zhì)細胞的OGD/再灌注損傷。OGD6h，再灌注24h后，CCK8檢測損傷星形膠質(zhì)細胞的活性，TUNEL檢測細胞凋亡，Western blot檢測凋亡相

6、關蛋白Bax、Bcl2和Caspase3的蛋白表達;免疫熒光檢測損傷星形膠質(zhì)細胞GFAP骨架蛋白表達，并觀察腫大細胞數(shù)變化，Western blot檢測GFAP蛋白表達情況。為進一步研究相關分子機制，p38 MAPK和JNK通路的抑制劑和激活劑，以及p38 MAPK和JNK下游通路p53和STAT1的抑制劑對上述模型加以干預，干預后采用同樣方式檢測損傷星形膠質(zhì)細胞的存活和反應性增生情況。
　　結(jié)果：以下各組，組間差異均具有統(tǒng)計學意

7、義(p＜0.05) BMSCs及BMSC-CM（含旁分泌因子）均能夠增加OGD/再灌注后損傷星形膠質(zhì)細胞的活性(p＜0.05);減少細胞的凋亡(p＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax(p＜0.05)和Caspase3(p＜0.05)，促進抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(p＜0.05)，與單純OGD/再灌注組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。另外，旁分泌因子還能減少腫大的星形膠質(zhì)細胞個數(shù)，并能顯著下調(diào)GFAP的過表達(p＜0.05)

8、。BMSCs及BMSC-CM干預后，單純OGD/再灌注激活的p38 MAPK和JNK及其下游通路p53和STAT1均被抑制，p-p38、p-JNK、p-p53、p53和p-STAT1蛋白表達均顯著下調(diào)(p＜0.05)。與單純OGD/再灌注組相比，p38 MAPK和JNK信號通路抑制劑，能夠顯著增加損傷星形膠質(zhì)細胞的活性(p＜0.05)，減少細胞的凋亡(p＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax(p＜0.05)和Caspase3(p＜0.05)

9、，促進抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(p＜0.05);并能顯著下調(diào)GFAP的過表達(p＜0.05)。單純OGD/再灌注損傷的星形膠質(zhì)細胞被p38 MAPK和JNK激動劑干預后，損傷星形膠質(zhì)細胞的活性顯著下降(p＜0.05)，凋亡數(shù)增加，促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達量增加(p＜0.05)，抑凋亡蛋白Bcl2表達量下降(p＜0.05)，并增加了GFAP的表達(p＜0.05);BMSC-CM加入p38 MAPK和JNK激動劑后，旁分泌

10、因子對損傷星形膠質(zhì)細胞活性的改善，細胞凋亡數(shù)和Bax，Caspase3，GFAP蛋白表達的抑制，Bcl2表達的促進作用均受到抑制(p＜0.05)。另外，與單純OGD/再灌注組相比，p53和STAT1信號通路抑制劑，能夠顯著增加損傷星形膠質(zhì)細胞的活性(p＜0.05)，減少細胞的凋亡(p＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase3，促進抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(p＜0.05);STAT1能顯著下調(diào)GFAP的過表達(p＜0.05)

11、，p53則無此效果(p＞0.05)。
　　結(jié)論：BMSCs旁分泌因子通過抑制p38 MAPK和JNK信號通路，進而保護OGD/再灌注后損傷的星形膠質(zhì)細胞，減少細胞凋亡并抑制GFAP的過表達，且p38 MAPK和JNK信號通路的下游分子p53與STAT1也參與了該過程。因此，BMSCs旁分泌因子對缺血性腦卒中后損傷星形膠質(zhì)細胞的藥理學作用是缺血性腦卒中治療的有效方式之一，其中p38 MAPK和JNK信號通路將會是潛在有效的治療靶點。

12、
　　第三章 BMSCs旁分泌因子對OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細胞其它生物學功能的影響
　　目的：初步探討B(tài)MSCs旁分泌因子對OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細胞氧化應激、炎癥反應、神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌、水通道蛋白以及谷氨酸轉(zhuǎn)運體表達的影響。
　　方法：以體外構(gòu)建的缺血性腦卒中模型（OGD模型）為基礎，對損傷后星形膠質(zhì)細胞用全培培養(yǎng)基（單純OGD/再灌注組，Standard組）、BMSC-CM（含旁分泌因子，Condit

13、ioned組）或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)（Co-cultured組）進行干預，以誘導星形膠質(zhì)細胞的OGD/再灌注損傷。OGD6h，再灌注24h后，DCFH-DA檢測ROS的產(chǎn)生，qPCR檢測免疫調(diào)節(jié)蛋白和炎癥因子（COX2，iNOS，TLR4，IL-6，IL-1β，TNF-α和IL-10），神經(jīng)營養(yǎng)因子(VEGF，BDNF和bFGF)，水通道蛋白(AQP4)以及谷氨酸轉(zhuǎn)運體（EAAT1和EAAT2）的mRNA表

14、達情況。
　　結(jié)果：以下各組，組間差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。BMSCs及BMSC-CM（含旁分泌因子）均能夠減少ROS的產(chǎn)生，抑制免疫調(diào)節(jié)蛋白和促炎因子COX2，iNOS，TLR4，IL-6，IL-1β，TNF-α的mRNA表達，促進抑炎因子IL-10和神經(jīng)營養(yǎng)因子VEGF，BDNF，bFGF的mRNA表達，并抑制水通道蛋白AQP4的mRNA上調(diào)和谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1，EAAT2的mRNA下調(diào)，與單純OGD/再灌注比

15、，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：BMSCs旁分泌因子能夠抑制OGD/再灌注后損傷的星形膠質(zhì)細胞ROS的產(chǎn)生;并能抑制OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細胞免疫炎癥反應，減少促炎的免疫調(diào)節(jié)蛋白和免疫反應因子的表達(IL-6，IL-1β，TNF-α，COX2，iNOS和TLR4)，同時也增加促炎因子IL-10的表達;促進神經(jīng)營養(yǎng)因子VEGF，BDNF和bFGF的表達;抑制OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細胞AQP4的過表達，