干細(xì)胞治療通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞促進(jìn)皮膚缺損的愈合.pdf

1、研究背景：皮膚是人體最大的器官，除了通過(guò)分泌、排泄和調(diào)節(jié)體溫來(lái)參與機(jī)體的新陳代謝外，更重要的是它覆蓋全身，是保護(hù)體內(nèi)各組織和器官的屏障，因此十分容易受到損傷。皮膚缺損往往繼發(fā)于創(chuàng)傷、手術(shù)、燒傷或一些代謝性疾病如糖尿病等，所以皮膚的損傷易伴發(fā)感染，形成壞疽，嚴(yán)重時(shí)甚至可以威脅生命，因此皮膚缺損的治療，尤其是難愈合性創(chuàng)傷及大面積全層皮膚缺損，一直以來(lái)都是國(guó)內(nèi)外皮膚及整形外科亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。近年來(lái)，組織工程快速發(fā)展，已有大量研究報(bào)道利用骨

2、髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚，通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的自我更新、高度增殖與多向分化使其成為創(chuàng)傷愈合豐富的細(xì)胞來(lái)源，從而修復(fù)皮膚缺損。然而，現(xiàn)有的幾種組織工程化皮膚雖然在治療皮膚缺損上取得了一定成效，但它們大多只是在結(jié)構(gòu)上與人體天然皮膚相似，雖然具有皮膚的屏障功能，但其韌性、外形以及機(jī)械性能仍明顯不如天然皮膚，并且在免疫、物質(zhì)及能量交換等功能方面上仍有較大差距，并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)真正意義上的皮膚重建。近來(lái)，MS

3、Cs的免疫調(diào)節(jié)能力受到越來(lái)越多的關(guān)注，應(yīng)用其免疫調(diào)節(jié)特性來(lái)治療各種疾病也顯示了較傳統(tǒng)治療難以比擬的優(yōu)勢(shì)，然而巨噬細(xì)胞（mΦ）作為損傷愈合中的免疫明星細(xì)胞，其在MSCs的系統(tǒng)注射調(diào)節(jié)免疫從而促進(jìn)皮膚損傷愈合中是否發(fā)揮作用，發(fā)揮怎樣的作用卻鮮有報(bào)道。明確各細(xì)胞在皮膚缺損的細(xì)胞治療中發(fā)揮的作用有利于更深刻的理解MSCs在皮膚缺損修復(fù)中對(duì)病理過(guò)程的潛在影響，從而在臨床上為皮膚缺損愈合的治療手段提供新思路。
　　研究目的：本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诤Y選

4、合適的種子細(xì)胞，探索干細(xì)胞治療促進(jìn)皮膚缺損愈合的可行性，明確其效應(yīng)的靶細(xì)胞及可能作用機(jī)制，為臨床治療皮膚缺損修復(fù)再生提供一定的理論依據(jù)及治療新思路。
　　方法：
　　1.體外組織塊培養(yǎng)法和有限稀釋法培養(yǎng)頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（JMMSCs）；骨髓穿刺法和密度梯度離心法培養(yǎng)長(zhǎng)骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)記；克隆形成、細(xì)胞周期以及Cell count kit8（CCK8）檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力；細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)比較兩

5、種細(xì)胞的遷移效率；成骨誘導(dǎo)后通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）活性，ALP染色、茜素紅染色，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western Blot）比較兩種細(xì)胞成骨能力；成脂誘導(dǎo)后通過(guò)油紅“O”染色，RT-PCR及Western Blot比較兩種細(xì)胞脂向分化能力。
　　2.建立小鼠皮膚缺損模型（n=48），隨機(jī)分為A組（BMMSCs組，I.V.，2×106)，B組（JMMSCs組，I.V.，2×106）和對(duì)照組C

6、組（PBS組，I.V.，200μL），觀察不同時(shí)間點(diǎn)各組皮膚缺損愈合情況并進(jìn)行組織切片的蘇木素伊紅（HE）、免疫組織化學(xué)及特殊染色，比較不同組別皮膚缺損愈合效率及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管生成，生長(zhǎng)因子分泌、細(xì)胞增殖及膠原纖維形成。
　　3.CM-DIL染色對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記和體內(nèi)示蹤，免疫熒光染色探索創(chuàng)緣處“歸巢”MSCs可能作用的靶細(xì)胞；通過(guò)氯膦酸二鈉的脂質(zhì)體（CL）尾靜脈注射建立巨噬細(xì)胞刪除小鼠模型，在此基礎(chǔ)上行皮膚缺損（n=20），隨機(jī)分

7、為D組（BMMSCs（mΦ-）組，I.V.，2×106）及對(duì)照E組（PBS（mΦ-）組，I.V.，200μL），觀察不同時(shí)間點(diǎn)皮膚缺損愈合大體情況并進(jìn)行組織切片的HE、免疫組織化學(xué)及特殊染色，比較不同組別皮膚缺損愈合效率，血管生成，生長(zhǎng)因子分泌、細(xì)胞增殖及膠原纖維形成。
　　4.密度梯度法及磁珠分選分離出外周血中的單核細(xì)胞，將其與兩種干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀與細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志的變化，脂多糖（LPS）及白細(xì)胞介素

8、（IL）-4分別刺激巨噬細(xì)胞得到M1、M2型巨噬細(xì)胞，RT-RCR檢測(cè)共培養(yǎng)后的巨噬細(xì)胞與誘導(dǎo)得到的M1、M2型巨噬細(xì)胞M1/M2型相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平差異，組織免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞治療組（A、B組）和PBS組（C組）皮膚缺損周?chē)M織巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志變化，RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)組織中巨噬細(xì)胞M1/M2型極化相關(guān)基因及蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.分離的JMMSCs和BMMSCs均陽(yáng)性表達(dá)CD14

9、6、STRO-1、CD105，陰性表達(dá)CD31、CD34、CD45；JMMSCs的克隆形成率、增殖速度高于BMMSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示JMMSCs處于增殖（S+G2）期的細(xì)胞占35.89％，多于BMMSCs的增殖期細(xì)胞所占百分比30.41%，而遷移速率上兩者無(wú)明顯差異；成骨誘導(dǎo)3、5、7天后，ALP活性檢測(cè)及染色結(jié)果顯示兩種細(xì)胞的ALP活性隨著時(shí)間上升且JMMSCs強(qiáng)于BMMSCs，誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色及定量顯示JMMSCs礦化

10、能力強(qiáng)于BMMSCs，RT-PCR和Western Blot顯示相關(guān)成骨指標(biāo)JMMSCs強(qiáng)于BMMSCs；成脂誘導(dǎo)后，油紅“O”染色及定量、RT-PCR和Western Blot顯示BMMSCs成脂能力稍強(qiáng)于JMMSCs組。
　　2.從第6天開(kāi)始，A、B兩組小鼠皮膚缺損的愈合效率明顯快于C組；Manson三色染色顯示，A、B組形成的藍(lán)色纖維較C組多且方向更整齊；HE染色顯示治療3天后，A、B兩組傷口附近炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于對(duì)照C組；

11、免疫組化顯示在細(xì)胞治療后第9天時(shí)，A、B兩組的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），血小板生成衍生因子（PDGF）和CD31陽(yáng)性細(xì)胞多于C組。
　　3.CM-DiL標(biāo)記的MSCs大量“歸巢”到皮膚缺損處，數(shù)量明顯多于正常皮膚處的標(biāo)記MSCs，并于與創(chuàng)緣周?chē)罅緾D68陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞在空間上有密切聯(lián)系；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠CL注射后，外周血中高表達(dá)CD14中等表達(dá)CD45的單核細(xì)胞大量減少，脾和肝的中CD68陽(yáng)性細(xì)胞較正常小鼠中減少，表明巨噬細(xì)

12、胞刪除小鼠模型建立成功；巨噬細(xì)胞刪除小鼠的皮膚缺損進(jìn)行細(xì)胞治療后（D組），其愈合效率與PBS治療的對(duì)照組（E組）沒(méi)有明顯差異，Manson三色染色顯示D、E兩組基本沒(méi)有藍(lán)色的膠原纖維形成；在細(xì)胞治療的第9天，D、E兩組的PCNA，PDGF和CD31免疫組化染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯差異。
　　4.流式細(xì)胞儀、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示與兩種干細(xì)胞共培養(yǎng)后，表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD206和CD163的巨噬細(xì)胞比例上升；RT-PCR檢測(cè)經(jīng)

13、共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞表達(dá)M2型相關(guān)基因水平較LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞和未誘導(dǎo)組高，接近于經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平。組織免疫熒光，RT-PCR及Western Blot都顯示相較PBS組，MSCs治療組皮膚缺損處巨噬細(xì)胞的M2型比例增加。
　　結(jié)論：
　　1.頜骨來(lái)源的JMMSCs是異于長(zhǎng)骨骨髓來(lái)源的BMMSCs的獨(dú)立細(xì)胞群體，其易于獲得分離,在體外可以迅速擴(kuò)增，在一定條件下同樣也是合適的種子細(xì)胞。
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