通過共培養(yǎng)模型初步探討脂肪干細胞促進放射性皮膚損傷修復的機制.pdf

1、研究背景和目的:
　　放療、職業(yè)暴露、意外事故、戰(zhàn)爭等多種原因都可以對皮膚造成放射性損傷。大劑量的輻射可致急性放射性潰瘍，小劑量輻射引起放射性皮炎，遷延不愈可造成慢性放射性潰瘍，若不及時治療，甚至可導致放射性皮膚癌。放射性皮膚損傷在臨床上通常表現(xiàn)為潛在性、進展性、難以愈合的特點，放射性皮膚潰瘍向深部發(fā)展，可以損傷肌肉、血管、神經(jīng)等深部組織，嚴重影響患者的生活質量，甚至威脅生命。目前在臨床中放射性皮膚損傷以放射性皮膚潰瘍最為常見，切

2、除病變組織，用皮瓣修復缺損是最為常見和有效的治療方法。
　　近年來，脂肪干細胞(ADSCs)作為再生醫(yī)學和組織工程領域內的研究熱點，從脂肪組織中提取，具有取材方便，供源廣泛的特點。ADSCs屬于間充質干細胞(MSCs)，具有多項分化潛能和免疫豁免的生物學特性，并能夠分泌多種細胞因子。因此，ADSCs具有廣泛的臨床使用前景。將ADSCs作用于放射性皮膚損傷的創(chuàng)面，在諸多臨床實驗、動物實驗中都證實了ADSCs促進組織修復的能力。由于A

3、DSCs具有向多種組織分化的潛能，因此在修復創(chuàng)面的過程中，可以直接分化為受損的組織細胞參與修復進程。然而隨著對ADSCs研究機制的不斷深入，越來越多的研究者們認為旁分泌作用在修復創(chuàng)面的過程中起主導作用，ADSCs可以分泌大量細胞因子包括生長因子、抗炎因子等，還可以釋放具有特殊功能的細胞外囊泡(EVs)，發(fā)揮抗凋亡、抗炎、促進血管生成的作用。然而，對于ADSCs逆轉放射性皮膚損傷的機制還需要進一步的研究。
　　我們通過將大鼠脂肪干細

4、胞(rADSCs)與輻射后的大鼠皮膚成纖維細胞(rFbs)隔以半透膜共同培養(yǎng)建立rADSCs修復放射性皮膚損傷的細胞模型，觀察共培養(yǎng)對rFbs放射性損傷的修復，探索ADSCs通過旁分泌作用促進放射性皮膚損傷愈合的機制，為進一步研究ADSCs修復放射性皮膚損傷奠定基礎。
　　本課題主要研究內容如下:
　　第一部分:大鼠脂肪干細胞、成纖維細胞的分離與鑒定
　　目的:分離并提取高純度的rADSCs、rFbs。
　　方法

5、:選取雄性SD大鼠，重約200-250g，腹腔注射水合氯醛麻醉后，取腹部皮下脂肪組織，將組織剪至2-4mm小塊，加入配好的混合酶溶液中，按要求設置組織處理器程序，分離出rADSCs。取大鼠腹部皮膚組織，剪去皮下粘膜，將組織剪成4mm×5mm大小的組織塊，放入分散酶溶液消化過夜，分離表皮和真皮，將真皮放入膠原酶溶液反應，分離出rFbs。將兩種細胞分別在鏡下觀察其形態(tài);CCK-8法描繪兩種細胞的生長曲線;流式細胞術檢測CD29、CD44、C

6、D31和CD45在rADSCs細胞表面的表達;成脂、成骨誘導培養(yǎng)鑒定其多向分化潛能;HE染色、波形蛋白免疫組化鑒定rFbs。
　　結果:在倒置顯微鏡下，大鼠原代rADSCs呈長梭形或多邊形，與成纖維細胞相似，細胞核大而明顯，位置居中，核仁明顯;大鼠皮膚rFbs在顯微鏡下形態(tài)清楚，呈現(xiàn)長梭形，核較小，呈卵圓形居中，細胞集落呈現(xiàn)旋渦狀或者菜花狀。流式細胞術顯示rADSCs中CD29、CD44呈陽性表達，表達率分別為99.42％、98.

7、29％，CD31、CD45呈陰性表達，誘導分化鑒定發(fā)現(xiàn)rADSCs具有成骨、成脂分化分能力，證明其有多向分化潛能。光鏡下，HE染色切片可見rFbs胞漿淡染，深染的細胞核呈圓形或橢圓形居于正中，免疫組化顯示rFbs的Vimentin陽性表達率幾乎為100％。CCK-8表明兩種細胞的都具有很強的增殖能力。
　　結論:通過酶消法提取的rADSCs和rFbs具有較高的純度和活性，為后面建立細胞模型作了充分準備。
　　第二部分:體外實

8、驗檢測放射對rFbs功能的影響
　　目的:通過建立輻射對rFbs的損傷模型，研究在不同輻射劑量、輻射后不同時間點下rFbs的狀況，為下一步共培養(yǎng)模型的建立確定合適的輻射劑量和時間觀測點。
　　方法:用直線加速器將rFbs分別予以2 Gy、8 Gy、16Gy、24Gy、32Gy的劑量進行輻照，設置未受輻照的對照組。用CCK-8法描繪各組rFbs的生長曲線;在輻照后第2、4、6天，通過流式細胞術檢測各組rFbs的細胞周期和細胞凋

9、亡，進行對比。
　　結果:隨著輻射劑量的增加，rFbs的增殖能力逐漸下降，細胞凋亡比率增加，細胞周期中G1期比例下降，G2期比例上升，G1/ G2比值下降，在輻射后第二天變化最為明顯。
　　結論:輻射會導致rFbs增殖能力下降，細胞凋亡增加，G2期阻滯，并且具有一定的劑量一效應關系。根據(jù)實驗結果，我們選擇輻射劑量為8Gy建立共培養(yǎng)模型，在輻射后第2天進行相關指標的檢測。
　　第三部分:體內、體外實驗檢測rADSCs通過

10、旁分泌作用修復rFbs放射性損傷
　　目的:將rADSCs與輻射后的rFbs隔以半透膜共同培養(yǎng)，其培養(yǎng)基能夠促進大鼠放射性皮膚損傷的愈合，并且rADSCs能夠通過旁分泌作用修復半透膜外rFbs的放射性損傷，說明共培養(yǎng)模型的有效性，進一步探討ADSCs的修復機制。
　　方法:在體內實驗中建立大鼠放射性皮膚損傷模型，分別將rADSCs、rADSCs共培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基在創(chuàng)面周圍局部注射，通過創(chuàng)面面積測量、HE和Masson染色觀

11、察創(chuàng)面組織結構變化，PCNA和Tunel實驗檢測細胞增殖和凋亡，免疫組化方法檢測創(chuàng)面組織CD31、TNF-α的表達，Western blot檢測生長因子VEGF的水平，綜合反映大鼠放射性創(chuàng)面的愈合狀況。在體外實驗中，按照分組進行細胞處理:A組—rADSCs與輻射后rFbs共培養(yǎng)組;B組—NRK與輻射后rFbs共培養(yǎng)組;C組—輻射后rFbs單獨培養(yǎng)組;D組—rADSCs與rFbs共同培養(yǎng)組;E組—rFbs單獨培養(yǎng)組。通過劃痕實驗比較各組r

12、Fbs遷移能力的差異，流式細胞儀檢測各組rFbs的細胞凋亡和細胞周期，EdU檢測各組rFbs的細胞增殖能力，Western blot檢測rFbs的CCND1、P53的水平，ELISA檢測培養(yǎng)基中TGF-β、GCSF、COLⅠ、COLⅡ等指標。
　　結果:在大鼠放射性皮膚損傷模型中，rADSCs共培養(yǎng)基應用于大鼠放射性創(chuàng)面中，可以降低炎癥反應，促進血管生成和膠原產(chǎn)生，增強細胞增殖能力，促進創(chuàng)面愈合。在體外實驗中，輻射可以引起rFbs

13、增殖、遷移能力下降，細胞凋亡增加，G2期阻滯，CCND1蛋白水平下降，P53蛋白水平升高，分泌細胞因子TGF-β水平升高，而GCSF、CollagenⅠ、CollagenⅡ水平下降。rADSCs共培養(yǎng)模型中rFbs增殖遷移能力明顯上升，細胞凋亡減少，G2期阻滯減輕，CCND1蛋白水平升高，在培養(yǎng)基中，TGF-β水平下降，而GCSF、CollagenⅠ、CollagenⅡ水平升高。
　　結論:rADSCs與輻射后rFbs的共培養(yǎng)基在