神經(jīng)干細胞移植促進創(chuàng)傷性損傷組織修復及其機制的研究.pdf

1、前言:
　　 創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)專指由外傷引起的腦組織損害,又稱顱腦損傷或頭部外傷。TBI是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的主要原因,特別是兒童和青年人。TBI的全球發(fā)病率正在增加,特別是在發(fā)展中國家。嚴重的TBI會立即導致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞受損以及和相關(guān)的神經(jīng)功能障礙,包括認知、情感和行為障礙,致殘率高、死亡率高。20世紀在診斷和治療領(lǐng)域的重大進展已經(jīng)明顯降低了死亡率。這種因TBI引起

2、的死亡率的下降導致了殘疾人口數(shù)量隨之增加,給社會和家庭造成巨大的經(jīng)濟負擔和精神負擔。對TBI造成的組織損傷后的修復治療是當前腦研究的熱點。
　　 研究表明,由創(chuàng)傷后的數(shù)分鐘至數(shù)天內(nèi)發(fā)生的一系列復雜的細胞生物化學過程導致了繼發(fā)性損傷。這一繼發(fā)過程可能是治療失敗、并成為在院TBI病人死亡的最主要原因。目前,尚沒有任何藥物可以阻止繼發(fā)性損傷的進展。由于神經(jīng)保護性治療可以限制。TBI后的損傷程度,停止或減輕繼發(fā)性損傷,已經(jīng)受到了極大的關(guān)

3、注。然而,臨床試驗中測試的可能阻止這些細胞損傷機制的方法在很大程度上都失敗了。
　　 近年來對于神經(jīng)干細胞(Neuralsterncells,NSCs)或神經(jīng)前體細胞(neuralprogenitorcells,NPCs)的研究為應用這些細胞治療腦損傷成為可能,TBI后的功能網(wǎng)絡重建已成為干細胞治療的目的之一。我們前期的研究表明,在選擇性的感覺運動功能試驗中,NSCs移植治療大鼠TBI后第1周,就起到了促進功能恢復的作用。盡管目

4、前體內(nèi)研究表明移植的NSCs會與受損的內(nèi)源性神經(jīng)元發(fā)生相互作用,但其具體作用機制尚不清楚。有研究認為這種對宿主細胞的保護和解救措施與NSCs釋放的某些保護因子或特殊神經(jīng)介質(zhì)以及存在于損傷腦組織中的細胞間信號有關(guān),然而,僅憑這一機制尚不足以闡明NSCs在移植中發(fā)揮的有利作用。
　　 因此,本研究應用改良的Feeney法制備TBI動物模型,NSCs腦內(nèi)移植后,于不同時間采用免疫組織化學、RT-PCR和免疫印跡等方法檢測移植點及其周圍

5、腦組織中細胞連接、細胞粘附和生長相關(guān)蛋白的表達改變,探討移植促進組織修復的相關(guān)機制,旨在為推廣臨床應用NSCs移植治療TBI提供可靠的實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 從E14SD大鼠胚胎分離NSCs,進行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng);用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基對NSCs進行誘導分化;采用免疫細胞化學技術(shù)對培養(yǎng)的NSCs和其分化為神經(jīng)元的表型進行鑒定。采用改良的Feeney法制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。利用腦立體定位儀和微量注射泵進行NS

6、Cs腦內(nèi)移植。采用免疫組織化學技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測在移植后不同時間腦組織損傷區(qū)縫隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)、整合素(integrin)的表達。構(gòu)建真核表達載體pcDNA-BDNF,采用非脂質(zhì)體的脂類轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染NSCs,應用免疫熒光雙標、激光共聚焦掃描顯微鏡和RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細胞BDNF和Nestin的表達和共存。分別將BDNF轉(zhuǎn)染的NSCs(BDNF/NSCs)和天然NSCs移植于TB

7、I動物腦內(nèi),比較BDNF/NSCs與NSCs于移植后不同時間點對腦組織損傷區(qū)BDNF和生長相關(guān)蛋白(grow-associatedprotein43,GAP43)mRNA和蛋白表達的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1、在培養(yǎng)基中,NSCs呈球團狀懸浮生長,Nestin表達陽性。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基對NSCs進行體外誘導分化,發(fā)現(xiàn)分化后第2天,多數(shù)細胞伸出突起,以后突起逐漸延長,分支增加。分化后第5d,部分細胞呈βⅢ-微

8、管蛋白陽性。
　　 2、免疫組織化學顯示,無論有無NSCs移植,在移植后第1、2和4w的受損腦組織中,均可見Cx43在細胞膜上、膜旁的胞漿里及在突起中呈棕黃色表達。NSCs移植大鼠的Cx43染色在各個時間點均顯著強于對照組(P＜0.05)。NSCs移植大鼠Cx43的mRNA表達相對值在1、2和4w分別為1.38±0.08,1.69±0.10和1.53±0.09;對照組大鼠Cx43的mRNA表達分別為0.55±0.14、0.91±

9、0.08和0.42±0.07。在移植后的4w內(nèi),在NSCs移植組移植點及其周圍腦組織中Cx43的mRNA和蛋白表達顯著高于對照組(P＜0.01)。
　　 3、整合素陽性產(chǎn)物主要表達于細胞膜,呈棕黃色。在對照組及移植組均可見陽性細胞表達。在不同時間點,NSCs移植組整合素陽性細胞均顯著多于對照組,同一時間點兩組間比較,差異有顯著性意義(P＜0.05)。NSCs移植組大鼠移植點及周圍腦組織中整合素的mRNA表達相對值在1、2和4w分

10、別為1.7l±0.07,1.92±0.11和1.83±0.08。對照組分別為0.81±0.06、1.25±0.07和1.17±0.09。在NSCs移植組移植點及其周圍腦組織中整合素的mRNA表達均顯著高于對照組(P＜0.01)。整合素的mRNA表達和蛋白表達結(jié)果相一致。
　　 4、克隆測序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒與參考序列完成一致,pcDNA3.1-BDNF質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳可見749bp和5.4kb兩

11、個條帶,其大小分別與載體pcDNA3.1和BDNFcDNA一致。轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)藥物篩選后第10d,免疫細胞化學染色顯示部分細胞呈Nestin及BDNF雙重陽性,RT-PCR檢測可見轉(zhuǎn)染細胞中BDNF呈高表達(P＜0.01)。
　　 5、RT-PCR和免疫印跡檢測結(jié)果顯示,在移植后第1、2w,BDNF/NSCs移植組損傷灶及周圍腦組織中的BDNF呈高表達。在移植后的4w內(nèi),與NSCs移植組相比,BDNF/NSCs移植組移植點及周圍腦組