S100A4蛋白在感覺神經(jīng)元再生以及損傷誘導(dǎo)的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移過程中的作用.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes,Ast)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和正常生理功能的維持中具有重要作用。根據(jù)Ast在CNS內(nèi)的分布，將其分為白質(zhì)Ast和灰質(zhì)Ast?；屹|(zhì)Ast主要與神經(jīng)元協(xié)作形成突觸網(wǎng)絡(luò)，白質(zhì)Ast則參與維持髓鞘化和非髓鞘化軸突上長距離沖動(dòng)傳導(dǎo)的安全性。Ast在CNS損傷和疾病中也發(fā)揮極其重要的作用。例如Ast參與形成膠質(zhì)瘢痕(glialscar)，修復(fù)損壞的膠質(zhì)邊界以及血腦屏障等。反應(yīng)性白質(zhì)Ast參與形成CNS微環(huán)境進(jìn)而影響

2、神經(jīng)再生，參與損傷后膠質(zhì)瘢痕的形成，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞有效地再髓鞘化等。成年哺乳動(dòng)物白質(zhì)Ast表達(dá)S100A4蛋白，而灰質(zhì)Ast不表達(dá)該蛋白。機(jī)械損傷導(dǎo)致白質(zhì)退形性變時(shí)，白質(zhì)AstS100A4表達(dá)量明顯升高。然而，目前尚不清楚S100A4蛋白在CNS內(nèi)的具體作用。 第一部分 S100A4蛋白在感覺神經(jīng)元再生過程中的作用 早先的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性給予S100A4蛋白處理可明顯刺激胎鼠海馬神經(jīng)元突起生長，保護(hù)胎鼠中腦

3、及新生鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元。然而，這些結(jié)果均來自純的神經(jīng)元培養(yǎng)條件，沒有神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互交流。因此，本研究采用神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)條件能較好地反映在體的實(shí)際情況。首先，我們研究白質(zhì)Ast對(duì)背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)細(xì)胞突起生長的影響；接著，進(jìn)一步研究白質(zhì)Ast內(nèi)、外S100A4蛋白在DRG細(xì)胞突起再生過程中的作用。結(jié)果如下： 1.DRG細(xì)胞在多聚-L-賴氨酸包被的cov

4、erslip上的生長情況 我們首先檢測(cè)成年Wistar大鼠DRG細(xì)胞在多聚-L-賴氨酸包被的coverslip(沒有星形膠質(zhì)細(xì)胞)上的生長情況。在該培養(yǎng)條件下，DRG細(xì)胞可以存活，但培養(yǎng)24h未見神經(jīng)元出芽。 2.DRG細(xì)胞與對(duì)照siRNA預(yù)處理的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，DRG細(xì)胞突起生長情況 為闡明胞內(nèi)S100A4蛋白的作用，我們將DRG細(xì)胞與S100A4siRNA處理的白質(zhì)Ast共培養(yǎng)，觀察DRG細(xì)胞突起生長

5、情況。 3.DRG細(xì)胞與S100A4蛋白處理的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，DRG細(xì)胞突起生長情況 為研究胞外S100A4蛋白是否影響與白質(zhì)Ast共培養(yǎng)的DRG細(xì)胞突起生長，首先，我們制備純的白質(zhì)Ast，加入重組的S100A4蛋白(5μg/ml)預(yù)處理2h，然后將分散的DRG細(xì)胞種于其上，共同培養(yǎng)。 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)：白質(zhì)Ast能幫助DRG細(xì)胞突起生長；白質(zhì)Ast胞內(nèi)的S100A4蛋白抑制DRG細(xì)胞突起生長；胞外的S1

6、00A4蛋白可有效克服白質(zhì)Ast胞內(nèi)S100A4蛋白對(duì)DRG細(xì)胞突起生長的抑制作用，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。 第二部分 S100A4蛋白在損傷誘導(dǎo)的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移過程中的作用 成年哺乳動(dòng)物白質(zhì)Ast表達(dá)S100A4蛋白，而灰質(zhì)Ast不表達(dá)該蛋白；機(jī)械損傷導(dǎo)致白質(zhì)退形性變時(shí)，白質(zhì)AstS100A4表達(dá)量明顯升高。最近的研究報(bào)道，離體條件下抑制白質(zhì)AstS100A4表達(dá)能增加Ast的遷移能力，S100A4蛋白有可能影

7、響Ast對(duì)于諸如正常組織完整性破壞之類病理事件的反應(yīng)。本研究，我們通過在離體和整體水平比較S100A4(+/+)、S100A4(-/-)白質(zhì)Ast對(duì)于機(jī)械損傷(scratch)、化學(xué)損傷(ethidiumbromide)的反應(yīng)，研究S100A4蛋白對(duì)于損傷誘導(dǎo)的白質(zhì)Ast遷移的影響，及其在損傷后膠質(zhì)瘢痕形成中的作用。 1.細(xì)胞培養(yǎng)條件下，胞內(nèi)S100A4蛋白對(duì)scratch損傷誘導(dǎo)的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響 取自P4大

8、鼠腦胼胝體區(qū)的Ast(白質(zhì)Ast)表達(dá)較高水平的S100A4蛋白。用S100A4siRNA轉(zhuǎn)染3d后，白質(zhì)AstS100A4表達(dá)水平下降90％以上。對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的白質(zhì)AstS100A4表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。Scratch24h后，在對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組損傷區(qū)附近，白質(zhì)Ast表達(dá)S100A4水平上調(diào)，其突起朝損傷部位延伸；Scratch48h后，表達(dá)S100A4的Ast再生突起已長至損傷所造成的缺損區(qū)，但沒有完全覆蓋該部位。

9、 2.動(dòng)物水平，胞內(nèi)S100A4蛋白對(duì)ethidiumbromide注射誘導(dǎo)的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響 向S100A4(+/+)和S100A4(-/-)小鼠單側(cè)脊髓背索注射溴乙啶(ethidiumbromide)，注射側(cè)出現(xiàn)脫髓鞘化以及膠質(zhì)細(xì)胞壞死，對(duì)側(cè)也有一定程度的類似反應(yīng)。S100A4(+/+)和S100A4(-/-)小鼠損傷程度相似。損傷4d后，S100A4(+/+)和S100A4(-/-)小鼠Ast反應(yīng)相似，但在S10