初級(jí)感覺神經(jīng)元內(nèi)PKACREB信號(hào)在骨癌痛大鼠中的作用研究.pdf

1、目的:
　　骨癌痛的發(fā)生發(fā)展隨著疾病的進(jìn)展而不斷變化，骨癌患者經(jīng)受的疼痛極為頻繁和嚴(yán)重，然而，骨癌疼痛的發(fā)生機(jī)制仍然不清楚。越來越多的數(shù)據(jù)資料表明，腫瘤形成的微環(huán)境，通過不斷刺激神經(jīng)末梢、提高初級(jí)傳入神經(jīng)元興奮性，誘發(fā)外周敏化，是導(dǎo)致骨癌痛發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。而PKA/CREB信號(hào)通路在外周疼痛的誘發(fā)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。本研究旨在探討PKA/CREB通路在骨癌痛誘導(dǎo)的外周敏化中的作用及其潛在的分子神經(jīng)機(jī)制。
　　方法:

2、>　　1.將32只雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組，n=16）和骨癌痛組（BCP組，n=16），分組后在大鼠一側(cè)脛骨髓腔中分別注入PBS或乳腺癌Walker256細(xì)胞，種植腫瘤細(xì)胞后第1，3，7，10，14天檢測(cè)大鼠機(jī)械痛閾。運(yùn)用熒光素(DiI)逆行標(biāo)記的方法，標(biāo)記支配脛骨的脊髓背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglion，DRG)，后再運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(Whole cell patch clamp)檢測(cè)大鼠脛骨相關(guān)

3、DRG的興奮性變化。
　　2.將32只骨癌大鼠隨機(jī)均分為DMSO組和H-89組（每組n=16）。在腫瘤細(xì)胞接種后的第9天至第14天每天相同時(shí)段鞘內(nèi)注射相同劑量的DMSO或H-89。分別在給藥前、給藥后15，30，45和60 min運(yùn)用Von Frey纖毛進(jìn)行機(jī)械痛閾的測(cè)試。在第14天最后一次鞘內(nèi)給藥后1h，快速提取大鼠患側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，運(yùn)用熒光素(DiI)逆行標(biāo)記的方法，標(biāo)記支配脛骨的脊髓背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Gang

4、lion，DRG)，后再運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(Whole cell patch clamp)檢測(cè)大鼠支配脛骨的DRG的興奮性變化。
　　3.應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)L2～L5中磷酸化CREB(phosphoryhted CREB，p-CREB)表達(dá)量，觀察其在接種腫瘤細(xì)胞后以及鞘內(nèi)注射PKA拮抗劑H-89后的變化。
　　結(jié)果:
　　1.與假手術(shù)組（sham組）相比，骨癌痛組（BCP組）大鼠出現(xiàn)外周痛覺超敏，表現(xiàn)

5、為機(jī)械痛閾明顯降低;同時(shí)膜片鉗記錄顯示骨癌痛組大鼠的靜息膜電位去極化變多，基強(qiáng)度降低，動(dòng)作電位數(shù)量變多，提示支配脛骨的DRG的興奮性升高。
　　2.H-89組大鼠的機(jī)械痛閾在鞘內(nèi)給予PKA拮抗劑H-89之后明顯提高。連續(xù)5天鞘內(nèi)注射H-8910 nmol/10μL能顯著降低H-89組大鼠L2～L5 DRG的興奮性。
　　3.與假手術(shù)組比較，骨癌痛組大鼠支配脛骨的背根神經(jīng)節(jié)中CREB磷酸化水平明顯升高，而連續(xù)5天鞘內(nèi)注射H-8