初級感覺神經(jīng)元動作電位時空可塑性的離子通道機制——病理痛信號的空間編碼-.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)可以對來自內(nèi)、外環(huán)境的信息進行轉(zhuǎn)化、編碼、整合、儲存和傳遞，這些過程主要是通過“全或無”的動作電位以規(guī)則或不規(guī)則放電的形式在神經(jīng)纖維上的傳導(dǎo)和突觸之間的傳遞實現(xiàn)的。通常將動作電位大小不隨刺激強度和傳導(dǎo)距離而發(fā)生改變現(xiàn)象稱作“全或無”，這一特性可以保證信息的精確性。目前，對動作電位串編碼的方式雖然有多種學(xué)說，例如平均頻率編碼(meanrate code)、群體編碼(population code)、時間編碼(temporal co

2、de)、模式編碼(pattern code)等等，但是關(guān)于動作電位串的模式與神經(jīng)信息的確切關(guān)系問題一直存在著爭論。最近的研究表明：大腦皮層神經(jīng)元活動模式可能不是利用精確的活動模式來進行信息編碼的。這對當(dāng)前關(guān)于神經(jīng)元節(jié)律編碼信息的觀點產(chǎn)生了極大的影響。是否存在節(jié)律編碼以外的信息傳遞方式呢？對此，我們知之甚少。
　　傷害性信息通常被認(rèn)為是在初級感覺神經(jīng)元和終末的傷害性感受器激活后形成的動作電位串，可以將危害機體的刺激信息(模式、強度、

3、時程）進行初級編碼，然后以一定時間序列沿著軀體感覺神經(jīng)纖維的中樞突向脊髓傳遞。與經(jīng)典的動作電位不同，由于離子通道的多樣性和多態(tài)性、特異性的離子通道阻斷劑的缺乏以及離子通道活性調(diào)節(jié)的多因素性，傷害性感受器動作電位產(chǎn)生機制以及在病理性痛中的作用不甚清晰。更為重要的是，由于長期受到“全或無”動作電位編碼信息理論的影響，目前對于病理過程中的單個動作電位時空參數(shù)(尤其是幅度和去極化時程)是否發(fā)生改變及其功能意義研究甚少。
　　本課題主要運用

4、膜片鉗技術(shù)，通過記錄和分析痛覺信息傳遞的第一級神經(jīng)元（DRG神經(jīng)元）動作電位的空間參數(shù)（幅度）和時間參數(shù)（去極化時程和復(fù)極化時程），從離體細胞水平和在體水平兩個層次上，分別研究神經(jīng)元周圍鈣離子的穩(wěn)態(tài)失衡和炎性病理性痛狀態(tài)下，DRG神經(jīng)元動作電位時空參數(shù)的變化特征。為了探討動作電位產(chǎn)生與可塑性的離子通道機理，我們進一步研究了兩種TTX-R鈉通道（NaV1.8和NaV1.9）在動作電位時空可塑性中的作用及功能意義。通過對神經(jīng)元單個動作電位時

5、空參數(shù)的研究，我們得到以下結(jié)果：
　　1.初級感覺神經(jīng)元動作電位不僅具有時間可塑性，還有空間可塑性
　　在沒有外在刺激因素的狀態(tài)下，自發(fā)放電的背根節(jié)（DRG）神經(jīng)元所產(chǎn)生動作電位具有“全或無”的特征，其時間參數(shù)和空間參數(shù)相同。向DRG神經(jīng)元內(nèi)連續(xù)10次注入相同的電流（強度300pA，間期：3ms，間隔200ms），所產(chǎn)生的動作電位具有“全或無”的特征，而向同一神經(jīng)元內(nèi)連續(xù)10次注入不同強度的電刺激（強度50-500pA，50

6、pA遞增），所產(chǎn)生的動作電位波形完全不同。為了進一步研究電刺激誘發(fā)動作電位的特性，我們采用了以下的電刺激參數(shù)：強度50-500pA，每次遞增50pA，共10串電刺激，每串電刺激的波寬0.5-5ms，每次遞增0.5ms，每個電刺激時間間隔200ms，電刺激總計數(shù)100個。結(jié)果顯示出以下特點：第一，動作電位的幅度在一定時間參數(shù)上不隨電刺激波寬的增加而改變，但隨電刺激強度的增加而增強。第二，動作電位的時程在同一閾上刺激強度時隨電刺激波寬的增加

7、而先縮短后恢復(fù)，但在同一波寬卻隨電刺激強度的增加而縮短。第三,動作電位的去極化時程在同一閾上刺激強度時不隨電刺激波寬的增加而改變，但隨電刺激強度的增加而縮短。第四,動作電位的復(fù)極化時程在同一閾上刺激強度時隨電刺激波寬的增加而先縮短后恢復(fù)，但在同一波寬卻隨電刺激強度的增加而縮短。這些結(jié)果說明：初級感覺神經(jīng)元動作電位具有時空可塑性。這種可塑性與電刺激參數(shù)有關(guān)，刺激電流的強度主要影響動作電位的幅度和去極化時程，而刺激電流波寬主要影響復(fù)極化時程

8、。
　　2.細胞內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)的維持有利于初級感覺神經(jīng)元動作電位保持‘全或無’的時空特征
　　1）細胞外鈣離子濃度改變對DRG神經(jīng)元動作電位的影響。形成全細胞模式后，依次將細胞外的鈣離子調(diào)整為（mM）：2.5Ca，0Ca，1Ca，5Ca和10Ca，分別記錄電刺激（參數(shù)：強度500pA，波寬3ms）誘發(fā)的動作電位。其中0Ca條件對動作電位的波形影響最大，可以使DRG神經(jīng)元動作電位的幅度明顯降低，復(fù)極化時程顯著延長，而對去極化時

9、程沒有明顯影響。由于細胞外0Ca時，DRG神經(jīng)元靜息膜電位向去極化方向移動約10mV，所以0Ca條件對動作電位時空參數(shù)的影響可能是通過對膜電位的影響而實現(xiàn)的。在5Ca和10Ca條件下，除去極化時程顯著延長外，其他參數(shù)沒有顯著變化。
　　2）細胞內(nèi)鈣離子濃度降低對DRG神經(jīng)元動作電位的影響。用0Ca外液和thapsigargin(Tg，1μM)共同孵育神經(jīng)元15min后，排空細胞內(nèi)鈣離子，記錄電刺激（參數(shù)：強度500pA，波寬3ms

10、）誘發(fā)的動作電位。結(jié)果顯示：細胞內(nèi)鈣離子降低后，可以使DRG神經(jīng)元產(chǎn)生的動作電位的幅度降低，總時程和復(fù)極化時程顯著延長，而去極化時程沒有明顯改變。
　　3）細胞內(nèi)鈣離子濃度升高對DRG神經(jīng)元動作電位時空參數(shù)的影響
　　首先，運用鈣離子成像和膜片鉗同步記錄技術(shù)，確定辣椒素（capsaicin）誘發(fā)的鈣離子升高持續(xù)時間、反應(yīng)幅度以及神經(jīng)元膜電位和內(nèi)向電流變化時程等參數(shù)。Capsaicin(0.5μM,10s)誘發(fā)的鈣離子濃度增加

11、的峰值出現(xiàn)在給藥后10s，神經(jīng)元內(nèi)鈣離子升高反應(yīng)可以持續(xù)120s以上，而內(nèi)向電流和膜電位在30s時，已經(jīng)基本恢復(fù)到初始水平。IP3受體阻斷劑2-APB（50μM）不能阻斷capsaicin誘發(fā)的反應(yīng)，而ryanodine受體阻斷劑釕紅（RutheniumRed，RR）10μM可以完全阻斷capsaicin誘發(fā)的鈣離子升高反應(yīng)，對內(nèi)向電流也有顯著的抑制作用。繼而，我們分別記錄capsaicin之前和停藥30s后，電刺（參數(shù)：強度500pA

12、，波寬3ms）激誘發(fā)的動作電位，結(jié)果顯示：細胞內(nèi)鈣離子升高可以使動作電位的幅度顯著降低，而對去極化時程和復(fù)極化時程均沒有影響。
　　3.外周炎癥條件刺激可以改變初級感覺神經(jīng)元動作電位的時空特性
　　前面的研究已經(jīng)表明：細胞水平的鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡可以引起動作電位的可塑性變化。那么在個體處于病理狀態(tài)下，動作電位是否會發(fā)生變化？其意義如何呢？我們進一步運用炎性病理性痛模型，研究病理條件下動作電位的時空特性。
　　1）行為學(xué)試驗

13、表明，大鼠足底注射CFA（100μl，溶于生理鹽水）1天或蜜蜂毒肽melittin（100μg/100μl，溶于生理鹽水）2h后，熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期（PWTL）和機械刺激閾值（PWMT）均顯著降低。在體電生理記錄表明，CFA或melittin致炎處理后，傷害性熱刺激（49℃水?。┮约懊ⅲ╞rush）、觸壓（pressure）和鉗夾（pinch）等機械刺激誘發(fā)的脊髓背角廣動力域（WDR）神經(jīng)元放電反應(yīng)均顯著增強。這些結(jié)果說明，CFA和

14、melittin足底注射可以誘發(fā)炎性痛反應(yīng)。
　　2）CFA和melittin致炎處理對DRG神經(jīng)元興奮性的影響。通過足底注射熒光指示劑DiI（1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，17mg/ml，溶于10％DMSO），我們可以鑒定出支配大鼠后肢足底的兩類DRG神經(jīng)元（即phasic神經(jīng)元和tonic神經(jīng)元）。結(jié)果顯示：CFA和meli

15、ttin致炎處理對兩類DRG神經(jīng)元興奮性的影響不同，tonic神經(jīng)元可以通過降低動作電位閾值和增加放電個數(shù)而提高神經(jīng)元的興奮性，而phasic神經(jīng)元的興奮性并未發(fā)生顯著改變。結(jié)果提示：在炎性病理性痛狀態(tài)下，傷害性信息可能同時以節(jié)律編碼和非節(jié)律編碼的方式進行傳遞。
　　3）CFA和melittin致炎處理對兩類DRG神經(jīng)元動作電位時空參數(shù)的影響。通過比較CFA或melittin致炎處理前后，相同的電流刺激（強度50-500pA，波寬

16、3ms，時間間隔200ms）誘發(fā)動作電位的波形，結(jié)果顯示：tonic神經(jīng)元的波形發(fā)生顯著性改變，電刺激下動作電位的幅度和超射值顯著增加，去極化時程和復(fù)極化時程均顯著縮短。而phasic神經(jīng)元動作電位波形的改變稍有不同：CFA致炎處理后phasic神經(jīng)元動作電位的幅度和超射值顯著增加，去極化時程和復(fù)極化時程均顯著縮短，而melittin致炎處理后，phasic神經(jīng)元動作電位的幅度和超射值顯著增加，復(fù)極化時程顯著縮短，但去極化時程沒有明顯變

17、化。結(jié)果提示：除了上述神經(jīng)元興奮性改變以外，在炎性病理性痛狀態(tài)下，DRG神經(jīng)元動作電位的波形也可以發(fā)生顯著變化，而這種改變可能是一種新的神經(jīng)元可塑性的表現(xiàn)。
　　4）炎性病理性痛條件下,動作電位時空可塑性變化可能與TTX-R鈉通道相關(guān)。在正常狀態(tài)下，給予相同的電流刺激（強度50-500pA，50pA遞增，波寬3ms，時間間隔200ms）誘發(fā)動作電位，TTX（1μM）可以使DRG神經(jīng)元的動作電位去極化時程明顯延長，幅度明顯減小。而大

18、鼠足底注射CFA(100μl)1天或melittin(100μg/100μl)2小時后，TTX的對動作電位幅度和去極化時程的影響明顯減弱了。結(jié)果提示：外周致炎處理后，形成動作電位的上升支和去極化時程的TTX-R鈉電流成分顯著增加。
　　4.TTX非敏感鈉通道表達上調(diào)是導(dǎo)致初級感覺神經(jīng)元動作電位空間可塑性的離子通道機制
　　1）免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常情況下，大鼠NaV1.8主要表達在中小直徑神經(jīng)元，而NaV1.9僅在小直徑

19、神經(jīng)元有表達。CFA或melittin致炎后，NaV1.8陽性神經(jīng)元平均計數(shù)分別增加了93％和50％，NaV1.9陽性神經(jīng)元平均計數(shù)分別增加了74％和47％。
　　2）Western blot結(jié)果顯示：正常情況下，大鼠DRG神經(jīng)元中NaV1.8和NaV1.9蛋白低表達。CFA處理組和melittin處理組中NaV1.8蛋白分別增加了84.25％和55.06％，而NaV1.9蛋白分別增加了51.97％和37.64％。
　　3）

20、RT-PCR結(jié)果顯示：正常情況下，大鼠DRG神經(jīng)元中NaV1.8和NaV1.9的處于低水平表達。CFA或melittin處理后NaV1.8的基因水平分別增加了116.02％和82.01％，而NaV1.9分別增加了87.86％和43.36％。
　　4）膜片鉗記錄TTX-R鈉電流的結(jié)果顯示：大鼠足底注射CFA(100μl)1天或melittin(100μg/100μl)2小時后，NaV1.8鈉電流和NaV1.9鈉電流均顯著增加。