初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的分泌和胞吞：?jiǎn)蝹€(gè)囊泡行為的全內(nèi)反射顯微成像(TIRFM)研究.pdf

1、位于背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)多種神經(jīng)肽，這些神經(jīng)肽從神經(jīng)元的末梢和胞體等區(qū)域的致密囊泡（DCV）分泌出來(lái)，起到調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸傳遞，細(xì)胞興奮性和調(diào)控基因表達(dá)等重要作用。分泌過(guò)程是神經(jīng)肽行使其功能的重要調(diào)節(jié)步驟，然而以往對(duì)于這一過(guò)程的研究主要在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞上進(jìn)行，對(duì)神經(jīng)元神經(jīng)肽分泌多采用生化方法檢測(cè)，不足以闡明這一精細(xì)調(diào)控的過(guò)程。因此我們采用實(shí)時(shí)成像的方法對(duì)DRG神經(jīng)元神經(jīng)肽分泌的調(diào)控進(jìn)行了研究。在此過(guò)程中，我們還意外地發(fā)

2、現(xiàn)了一個(gè)內(nèi)吞的負(fù)向調(diào)控因子，于是我們進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。本論文將分別對(duì)這兩部分工作進(jìn)行介紹。
　　第一部分研究DRG神經(jīng)元神經(jīng)肽分泌的調(diào)控。我們首次將全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）成像應(yīng)用于DRG神經(jīng)元，用NPY‐pHluorin作為分子標(biāo)記，在單個(gè)囊泡水平觀察刺激引起的神經(jīng)肽分泌。TIRFM記錄到的單囊泡分泌事件有NPY‐pHluorin“完全釋放型”和“不完全釋放型”兩種，提示DRG神經(jīng)元中神經(jīng)肽的分泌受到融合小孔

3、（fusion pore）的調(diào)節(jié)。對(duì)胞體和軸突的同時(shí)記錄發(fā)現(xiàn)，除了我們已知的胞體分泌，DRG神經(jīng)元的軸突各部分也存在刺激依賴(lài)的DCV分泌，兩者對(duì)于刺激的響應(yīng)均表現(xiàn)出較長(zhǎng)的延遲。去極化及電刺激引起的軸突囊泡分泌的數(shù)量顯著多于胞體，分泌時(shí)程也顯著快于胞體，盡管軸突的內(nèi)鈣濃度并不比胞體更高，說(shuō)明DCV在不同細(xì)胞區(qū)域的分泌位點(diǎn)受到嚴(yán)格的調(diào)控。然而激活DRG神經(jīng)元上的溫度敏感通道TRPV1引起的神經(jīng)肽分泌在軸突和胞體間沒(méi)有明顯的差異，其單個(gè)事件的

4、動(dòng)力學(xué)與去極化引起的分泌有顯著的不同，有更多的不完全釋放型的事件發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)表明不同的生理刺激可以對(duì)分泌的位點(diǎn)和融合小孔進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)節(jié)遞質(zhì)的分泌。
　　第二部分研究DRG神經(jīng)元內(nèi)吞的調(diào)控機(jī)制。內(nèi)吞過(guò)程的精確和有效的調(diào)控對(duì)于突觸傳遞，細(xì)胞膜平衡，細(xì)胞膜表面的通道和受體的平衡等都具有重要的作用。目前對(duì)于囊泡循環(huán)已有大量研究，多集中于發(fā)現(xiàn)促進(jìn)囊泡快速有效回收的分子機(jī)制上，而我們意外地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制，我們認(rèn)為這樣的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制能

5、提高囊泡回收的精準(zhǔn)性。在研究synaptotagmin-11（syt11）在DRG神經(jīng)元中的功能時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)它的knockdown（KD）顯著加速了dynamin依賴(lài)的刺激偶聯(lián)的內(nèi)吞，而沒(méi)有影響分泌。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，syt11 KD的神經(jīng)元中，clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨內(nèi)吞這兩種主要囊泡回收機(jī)制的發(fā)生頻率都有增加，同時(shí)也組成型的內(nèi)吞也被加速。另外在海馬神經(jīng)元中，syt11也同樣抑制了內(nèi)吞過(guò)程，說(shuō)明它對(duì)內(nèi)吞的調(diào)控可能普遍存在于神經(jīng)元