環(huán)氧化酶-2涉及脂多糖誘導的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種老年人常見的慢性神經(jīng)退行性疾病。常見于50歲以上老年人，并且隨著年齡的增加發(fā)病率逐漸增高。其主要臨床表現(xiàn)為震顫、肌張力增高、運動遲緩和姿勢異常。中腦黑質(zhì)(SN)多巴胺神經(jīng)元進行性變性壞死和黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺含量減少是其病理特點。PD的確切病因尚不完全清楚，目前的多巴胺替代治療雖然可以緩解癥狀，但是隨著用藥時間的延長療效逐漸降低，同時也不能阻止黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的進行性變性和進

2、展。因此探討和闡明PD的病因和發(fā)病機制，尋求和開發(fā)新的治療藥物減緩或阻止疾病的進展是治療PD的希望。 近年來越來越多的證據(jù)表明炎癥是介導黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元死亡的決定性因素，以小膠質(zhì)細胞激活為特征的神經(jīng)炎癥在PD的發(fā)病機制中起重要作用。細菌脂多糖(LPS)是一種強烈的炎癥刺激物和小膠質(zhì)細胞激活劑，它和其他神經(jīng)毒素如MPTP、6-OHDA不同。LPS并不直接殺傷多巴胺神經(jīng)元，而是通過激活小膠質(zhì)細胞釋放一系列的促炎癥反應(yīng)因子和細胞毒性因

3、子如白細胞介素一1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、反應(yīng)性氧自由基(ROS)以及前列腺素(PG)等導致神經(jīng)元變性。提示LPS誘導的多巴胺神經(jīng)元變性是研究炎癥反應(yīng)在PD發(fā)病機制中作用的理想模型。但是這些因子在LPS誘導的多巴胺神經(jīng)元變性中的作用研究結(jié)果不一，實際上炎癥導致黑質(zhì)神經(jīng)元死亡是一個十分復雜的過程，這些因子之間也存在相互影響和相互作用，故確定主要的分子通路對篩選PD的治療藥物是十分重要的。

4、 環(huán)氧化酶(COX)是花生四烯酸代謝產(chǎn)生PG過程中的主要限速酶，COX同功酶之一COX-2是一種重要的炎癥介質(zhì)，炎癥反應(yīng)伴隨COX-2表達增加和前列腺素E<,2>(PGE<,2>)水平增高與許多神經(jīng)疾病的病理過程中神經(jīng)元的變性和凋亡有關(guān)。但是研究PD炎癥機制的理想模型-LPS誘導的多巴胺神經(jīng)元變性中COX-2的作用尚不清楚，COX-2是否確實介導了了DA神經(jīng)元炎癥損傷，高度選擇性COX-2抑制劑是否抑制該損傷途徑，目前尚未見報道。明確L

5、PS介導的多巴胺神經(jīng)元變性中COX-2的作用機制以及細胞和分子通路將會為PD的治療提供新的方向。 本研究首先使用LPS處理中腦原代培養(yǎng)體系觀察了COX-2的細胞起源、COX-2表達的變化以及選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對多巴胺神經(jīng)元的保護作用；其次建立了黑質(zhì)內(nèi)注射 LPS 誘導的多巴胺神經(jīng)元變性的動物炎癥模型，使用免疫印跡技術(shù)研究黑質(zhì)內(nèi)注射LPS大鼠不同時間點COX-2蛋白表達的變化；并進一步研究了塞來昔布是否在體內(nèi)對黑質(zhì)多巴

6、胺神經(jīng)元有保護作用，探討COX-2在炎癥介導的多巴胺神經(jīng)元變性中的作用以及機制。 1、體外細胞培養(yǎng)中COX-2介導LPS對多巴胺神經(jīng)元的毒性作用 目的：中腦原代細胞培養(yǎng)中LPS誘導的多巴胺神經(jīng)元變性是體外研究PD的神經(jīng)炎癥機制和篩選有效的PD抗炎藥物的理想模型。使用中腦原代細胞培養(yǎng)建立炎癥介導的DA神經(jīng)元變性的體外模型，使用此模型探討COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對多巴胺神經(jīng)元的保護作用及其機制。 方法：孕14d

7、 SD大鼠胚胎中腦原代培養(yǎng)7d后，分別加入溶劑或COX-2選擇性抑制劑塞來昔布20μM預處理30min，然后加入LPS(20ng/ml)培養(yǎng)72h，對中腦原代培養(yǎng)細胞固定進行免疫熒光染色，取上清液進行放免法測定PGE<,2>和TNF-α。 結(jié)果：LPS能明顯減少TH-ir 細胞數(shù)目，僅為對照組的48％；塞來昔布預處理后存活的TH-ir神經(jīng)元數(shù)增加，為對照組的69％。單獨塞來昔布處理對TH-ir 細胞數(shù)目無明顯影響。形態(tài)上分析塞來

8、昔布也能顯著改善LPS對TH-ir細胞的損傷程度；同時發(fā)現(xiàn)LPS能增加小膠質(zhì)細胞數(shù)目到對照組的3.48倍；部分小膠質(zhì)細胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則。塞來昔布預處理后小膠質(zhì)細胞數(shù)目僅為對照組的2倍，不規(guī)則形態(tài)細胞也顯著減少；另外塞來昔布預處理后COX-2免疫陽性細胞密度也較LPS組明顯減少。雙標記法發(fā)現(xiàn)COX-2陽性細胞為小膠質(zhì)細胞；對照組中腦原代培養(yǎng)上清液中PGE和TNF-α的水平分別為65.27±33.13pg/ml和10.75±0.09p

9、mol/L，LPS能明顯增加上清液中PGE<,2>和 TNF-α的水平(分別為531.65±69.59pg/ml和13.24±0.62 pmol/L，P<0.05)，塞來昔布能抑制LPS誘導的PGE2和 TNF-α含量的增加(190.52±73.10pg/ml，11.19±0.52pmol/L,P<0.05)。 結(jié)論： LPS刺激小膠質(zhì)細胞激活，增加其表達COX-2和分泌PGE<,2>、TNF-α，導致DA神經(jīng)元的變性。塞來昔布

10、通過抑制小膠質(zhì)細胞激活以及COX-2表達，減少細胞外PGE<,2>、TNF-α水平發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。COX-2涉及中腦原代培養(yǎng)中LPS誘導的多巴胺神經(jīng)元變性過程。 2、黑質(zhì)內(nèi)注射LPS對多巴胺神經(jīng)元的毒性作用 目的：觀察黑質(zhì)內(nèi)注射脂多糖(LPS)對多巴胺神經(jīng)元的毒性作用，探討帕金森病的炎癥機制。 方法：35只SD大鼠隨機分為5組，分別為正常組、6h組、24h組、14d和30d組。使用立體定向技術(shù)黑質(zhì)內(nèi)注射15μ

11、g LPS，采用免疫組織化學方法觀察注射后不同時間點大鼠黑質(zhì)TH-ir細胞的減少以及小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學變化。 結(jié)果：LPS注射后6h、24h、14d、30d TH-ir細胞存活率分別為對側(cè)的90.1±7.05％(和對照組比較 P>0.05)，57.4±5.72％，16.0±5.84％，14.9±5.74％(和對照組比較均 P<0.05，其中24h和6h、14d、30d比較 P<0.05；14d和30d比較P>0.05)。黑質(zhì)小膠

12、質(zhì)細胞6h出現(xiàn)部分激活，24h和14d激活達高峰，30d時又恢復靜止狀態(tài)。 結(jié)論：黑質(zhì)內(nèi)注射LPS能誘導小膠質(zhì)細胞激活，隨后導致時間依賴性的多巴胺神經(jīng)元變性。它是研究神經(jīng)炎癥和多巴胺神經(jīng)元變性的關(guān)系的一種理想的實驗研究模型。 3、LPS誘導的大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性中COX-2蛋白表達 目的：使用黑質(zhì)內(nèi)注射LPS的PD炎癥模型，觀察LPS誘導的大鼠多巴胺神經(jīng)元變性過程中黑質(zhì)COX-2蛋白表達和。PGE<,2>水平

13、的變化。 方法：60只SD大鼠隨機分為5組，分別為黑質(zhì)內(nèi)注射PBS組、黑質(zhì)內(nèi)LPS注射后6h組、24h組、14d組和30d組。在黑質(zhì)立體定向注射15μg LPS后不同時間點分別使用免疫組化方法觀察黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)元數(shù)目的變化，免疫印跡法檢測黑質(zhì)COX-2蛋白表達以及放射免疫方法測定 PGE<,2>水平。 結(jié)果：LPS注射后6h TH-ir細胞數(shù)目和對照組無明顯變化，24h顯著減少，14d達到高峰；黑質(zhì)CO

14、X-2蛋白表達在6h即開始增高(194.34±9.68A)，24h繼續(xù)增高(211.23±7.05A)，14d達到高峰(256.07±16.32A)，在30d仍高于對照組(162.9±75.03A)，和對照組(90.79±11.59A)比較差異有顯著性意義(P均<0.05)。黑質(zhì)和血PGE<,2>水平雖然增加，但并不和COX-2蛋白表達平行，黑質(zhì)和血PGE<,2>水平分別在注射后6h、24h達到高峰。 結(jié)論：LPS誘導的黑質(zhì)多巴

15、胺神經(jīng)元變性過程中存在COX-2蛋白表達增加。 4、塞來昔布對LPS誘導的多巴胺神經(jīng)元變性的保護作用 目的：進一步探討選擇性COX-2抑制劑塞來昔布在體內(nèi)對LPS誘導的多巴胺神經(jīng)元變性的保護作用及其機制。 方法：30只SD大鼠隨機分成3組：磷酸緩沖液(PBS)對照組、生理鹽水+LPS組和塞來昔布+LPS組。黑質(zhì)內(nèi)立體定向注射15μg LPS或PBS，塞來昔布或生理鹽水治療組在注射LPS前3h開始灌胃，劑量為20m

16、l．kg<'-1>．d<'-1>，鹽水組灌注等量生理鹽水，持續(xù)到注射后14d。采用免疫組織化學方法觀察注射后14d大鼠TH-ir細胞的減少以及小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學變化，免疫印跡法檢測黑質(zhì)COX-2 蛋白表達以及放射免疫方法測定PGE<,2>和 TNF-α水平。 結(jié)論：塞來昔布在體內(nèi)通過COX-2途徑抑制小膠質(zhì)細胞激活以及神經(jīng)毒性因子的釋放，阻止多巴胺神經(jīng)元的變性和丟失。COX-2 涉及體內(nèi)炎癥介導的多巴胺神經(jīng)元變性機制。

17、總之，LPS對DA神經(jīng)元的毒性作用機制中存在COX-2、小膠質(zhì)細胞和變性壞死的DA神經(jīng)元之間的惡性循環(huán)。首先LPS刺激小膠質(zhì)細胞激活，激活的小膠質(zhì)細胞高度表達COX-2，同時分泌一些神經(jīng)毒性因子如 TNF-α等導致 DA 神經(jīng)元的損傷；而COX-2的高度表達產(chǎn)生大量的PG和ROS，又加劇小膠質(zhì)細胞的激活和DA神經(jīng)元的變性死亡，損傷的DA神經(jīng)元也能反過來激活小膠質(zhì)細胞，如此的惡性循環(huán)造成DA神經(jīng)元的持續(xù)和進行性變性。而COX-2抑制劑通過