17β雌二醇通過PI3K-Akt途徑抑制腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的人髓核細(xì)胞的凋亡.pdf

1、目的：
　　以往研究證實腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)能夠誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡。17β雌二醇能抑制細(xì)胞凋亡的功能也得到了廣泛的證實。PI3K/Akt途徑是抑制細(xì)胞凋亡的細(xì)胞傳導(dǎo)通路。本研究的目的是探索17β雌二醇能否通過PI3K/Akt途徑抑制腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的人髓核細(xì)胞凋亡。
　　方法：
　　用人髓核細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，按照以下處理條件進(jìn)行實驗分組，每組為6個樣本。Ⅰ組（對

2、照組）：未對人髓核細(xì)胞進(jìn)行特殊處理；Ⅱ組：用TNF-α（100 ng/ml）對人髓核細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)；Ⅲ組：用17β-E2（10μm/L）預(yù)先處理后加入TNF-α（100 ng/ml）對人髓核細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)；Ⅳ組：用17β-E2（10μm/L）和MK2206(10μm/L，PI3K/AKT途徑抑制劑)同時預(yù)先處理后加入TNF-α（100 ng/ml）對人髓核細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。分別從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、蛋白分子和核酸分子水平對人髓核細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行評估，運(yùn)

3、用：1倒置相差顯微鏡對人髓核細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；2流式細(xì)胞學(xué)對人髓核細(xì)胞的早期凋亡率進(jìn)行定量分析；3細(xì)胞增殖活性檢測(CCK-8)對人髓核細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行定量分析；4用caspase-3活性檢測試劑盒檢測人髓核細(xì)胞中caspase-3蛋白活性；5用蛋白印跡法(Western blot)對人髓核細(xì)胞中pro-caspase-3、caspase-3/P17、cleaved PARP, PARP、Akt和 p-Akt蛋白表達(dá)進(jìn)行定量檢測，以

4、相對灰度值（/GADPH）表示；6用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法對人髓核細(xì)胞中 caspase-3/p17、PARP和Akt mRNA表達(dá)進(jìn)行定量檢測，并且以相對ct值（/GADPH）表示。
　　結(jié)果：
　　1人髓核細(xì)胞呈現(xiàn)出多角形生長，且輪廓明顯，細(xì)胞核呈現(xiàn)出圓形以及橢圓形，細(xì)胞可在6-8小時貼壁生長，7-8天可進(jìn)入對數(shù)生長期。
　　2倒置相差顯微鏡，在Ⅰ組中，未見人髓核細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡；與Ⅰ組相比

5、，Ⅱ組中可見人髓核細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡；Ⅲ組中，未見人髓核細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡；與Ⅲ組相比，Ⅳ組中可見人髓核細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。
　　3流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果顯示：Ⅰ組人髓核細(xì)胞早期凋亡率為12.05％±2.27%；Ⅱ組人髓核細(xì)胞早期凋亡率為30.8%±8.36%；Ⅲ組人髓核細(xì)胞早期凋亡率為13.81%±1.97%；Ⅳ組人髓核細(xì)胞早期凋亡率為30.01%±7.33%。Ⅰ組早期凋亡率明顯低于Ⅱ組（P＜0.001），Ⅱ組早期凋亡率明顯高于Ⅲ組（P＜

6、0.001），Ⅲ組早期凋亡率明顯低于Ⅳ組（P＜0.001）。
　　4用細(xì)胞增殖與活性檢測(CCK-8)結(jié)果顯示：Ⅰ組人髓核細(xì)胞增殖活性 OD值為90.32%±3.25%；Ⅱ組人髓核細(xì)胞增殖活性 OD值為37.78%±3.28%；Ⅲ組人髓核細(xì)胞增殖活性O(shè)D值為88.67%±2.87%；Ⅳ組人髓核細(xì)胞增殖活性O(shè)D值為38.97%±3.49%。Ⅰ組細(xì)胞增殖活性明顯高于Ⅱ組（P＜0.001），Ⅱ組細(xì)胞增殖活性明顯低于Ⅲ組（P＜0.001）

7、，Ⅲ組細(xì)胞增殖活性明顯高于Ⅳ組（P＜0.001）。
　　5用caspase-3活性檢測試劑盒來檢測細(xì)胞中caspase-3蛋白活性，與Ⅰ組相比，Ⅱ組中人髓核細(xì)胞在TNF-α干預(yù)下caspase-3蛋白活性增加3.9倍，Ⅲ組中，在17β-E2預(yù)處理后人髓核細(xì)胞的caspase-3的活性增加1.1倍，而Ⅳ組，在17β-E2和MK2206預(yù)處理后caspase-3蛋白活性增加3.7倍。Ⅰ組和Ⅱ組、Ⅱ組和Ⅲ組、Ⅲ組和Ⅳ組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（

8、P＜0.001）。
　　6 Western blot結(jié)果顯示：四組(Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組)中caspase-3/p17蛋白的灰度值（/GAPDH）分別0.13±0.01、0.39±0.01、0.12±0.01、0.38±0.01；四組中cleaved PARP蛋白的灰度值（/GAPDH）分別0.13±0.01、0.33±0.01、0.14±0.01、0.32±0.01；四組中pro-caspase-3蛋白的灰度值（/GAPDH）

9、分別0.40±0.01、0.11±0.01、0.38±0.01、0.12±0.01；四組中PARP蛋白的灰度值（/GAPDH）分別0.35±0.02、0.16±0.01、0.35±0.01、0.15±0.01；四組中p-Akt蛋白的灰度值（/GAPDH）分別0.14±0.02、0.30±0.01、0.43±0.02、0.13±0.02，以上蛋白的灰度值在Ⅰ組和Ⅱ組、Ⅱ組和Ⅲ組、Ⅲ組和Ⅳ組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。而四組中Akt

10、蛋白的灰度值（/GAPDH）分別0.49±0.02、0.48±0.01、0.49±0.02、0.48±0.01，其組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TNF-α干預(yù)后的人髓核細(xì)胞中p-Akt蛋白的灰度值（/GAPDH）在0到24小時內(nèi)升高，而在24到48小時下調(diào)，24小時為p-Akt的表達(dá)高峰（0.10±0.01、0.18±0.01、0.33±0.02、0.18±0.01、0.10±0.01），0時與12時、12時與24時、24時與36時和36時與4

11、8時之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。但Akt蛋白表達(dá)水平保持不變（0.48±0.01、0.48±0.01、0.49±0.02、0.48±0.02、0.49±0.01，P＞0.05）。雖然，17β-E2干預(yù)后的人髓核細(xì)胞中 p-Akt蛋白的灰度值（/GAPDH）在0到48小時內(nèi)升高（0.06±0.01、0.15±0.01、0.25±0.02、0.33±0.02、0.44±0.01），以上蛋白灰度值各組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001

12、），但Akt蛋白表達(dá)水平保持不變（0.44±0.03、0.44±0.03、0.45±0.02、0.46±0.04、0.47±0.05，P＞0.05）。
　　7實時定量PCR檢測結(jié)果顯示：caspase-3/p17 mRNA的ct值（/對照組）分別2.45±0.23、0.98±0.15、2.50±0.13，四組中PARP mRNA的ct值（/對照組）分別0.30±0.03、0.95±0.03、0.27±0.04，以上mRNA的ct值