反義miR-221-222抑制Akt通路活性提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：惡性膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長，手術(shù)難以完全切除，術(shù)后放射治療是膠質(zhì)瘤綜合治療中較為重要的手段。但由于惡性膠質(zhì)瘤具有放射抗性致其放射治療效果欠佳，所以人們一直在探索惡性膠質(zhì)瘤放射抗性的機(jī)制及應(yīng)對方法。最近，多個(gè)研究證實(shí)microRNAs(miRs)在膠質(zhì)瘤與正常腦組織間表達(dá)存在明顯差異。其中，膠質(zhì)瘤中miR-221與miR-222(miR-221/222)的表達(dá)明顯高于正常腦組織。同時(shí)，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-221/222通過Akt信號(hào)通路發(fā)

2、揮作用。因此我們擬通過敲低膠質(zhì)瘤中miR-221/222，抑制Akt通路活性，以達(dá)到提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性的作用。
　　方法：
　　1.體外實(shí)驗(yàn)：膠質(zhì)瘤U251，LN-229細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，將上述兩種細(xì)胞各分為3組，分別是對照組、轉(zhuǎn)染無義序列組和反義miR-221/222共轉(zhuǎn)染組；用Lipofectamine2000進(jìn)行脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染反義寡聚核苷酸(反義miR-221/222)；將上述各組細(xì)胞用Trizo

3、l試劑提取總RNA，用Northern印跡方法測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-221、miR-222的表達(dá)水平；取對照組、轉(zhuǎn)染無義序列組和反義miR-221/222共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別進(jìn)行0 Gy，2 Gy，4 Gy，6 Gy X線照射(源皮距為100 cm，劑量率為320 cGy/min，瓦里安600C加速器6 MV X線照射)，每組的每個(gè)劑量點(diǎn)均重復(fù)3次，然后用克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性；Western印跡分析轉(zhuǎn)染和照射前后的各組

4、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的pAkt蛋白表達(dá)變化。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：建立U251裸鼠皮下荷瘤模型，將32只已長成的皮下荷瘤裸鼠分為對照組、照射組、反義miR-221/222轉(zhuǎn)染組和反義miR-221/222轉(zhuǎn)染聯(lián)合照射組，每組8只，各組裸鼠腫瘤平均體積約50mm3；反義miR-221/222聯(lián)合X線照射治療裸鼠皮下移植瘤，觀察腫瘤生長水平；Real-time PCR檢測治療后miR-221、miR-222的表達(dá)；免疫組化分析各組裸鼠皮下移植瘤組

5、織的pAkt蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Northern印跡分析顯示反義miR-221/222可以有效的敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的miR-221和miR-222的表達(dá)水平?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)證實(shí)反義miR-221/222聯(lián)合X線照射可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性。Western印跡分析顯示反義miR-221/222可下調(diào)pAkt蛋白表達(dá)。經(jīng)反義miR-221/222轉(zhuǎn)染聯(lián)合X線照射治療后，裸鼠皮下移植瘤生長明顯受抑，腫瘤組織中miR-221/miR-2

6、22表達(dá)水平下降，pAkt蛋白表達(dá)水平也明顯降低。
　　結(jié)論：我們用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染反義寡聚核苷酸的方法敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-221、miR-222的表達(dá)，并經(jīng)Northern印跡證實(shí)。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中顯示反義miR-221/222聯(lián)合X線照射可以明顯減少細(xì)胞克隆形成率，這說明二者聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以明顯增加細(xì)胞的增殖性死亡幾率，增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性。經(jīng)Western印跡分析證實(shí)敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-221、miR-222

7、的表達(dá)后pAkt蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)。同樣，體外研究結(jié)果在體內(nèi)獲得證實(shí)。我們經(jīng)反義miR-221/222轉(zhuǎn)染聯(lián)合X線照射治療后，裸鼠皮下移植瘤生長明顯受抑。腫瘤組織中miR-221/222表達(dá)水平，pAkt蛋白表達(dá)水平明顯降低。種種證據(jù)均說明轉(zhuǎn)染反義miR-221/222后，膠質(zhì)瘤放射敏感性的提高與其pAkt蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。因此，我們認(rèn)為反義miR-221/222通過抑制Akt通路活性來增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性。這為今后惡性膠質(zhì)瘤放