CpG ODN107增強(qiáng)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞放射敏感性的體內(nèi)外生物學(xué)活性及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　腦膠質(zhì)瘤(gliomas)是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高和治愈率低的特點(diǎn)。由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,手術(shù)治療無法將其完全切除,手術(shù)后聯(lián)合放射治療是目前腦膠質(zhì)瘤的首選治療方法。但腦膠質(zhì)瘤對(duì)射線不敏感或放射治療一段時(shí)間后對(duì)射線敏感性降低,放射增敏劑可提高射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,增強(qiáng)放療療效。因此,研制高效的放射增敏劑并闡明其作用機(jī)制、靶點(diǎn),對(duì)提高腦膠質(zhì)瘤的治愈率具有重要意義。
　　NO是

2、最有效的腫瘤放射增敏分子。在缺氧條件下,NO能提高瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性,但其對(duì)人體具有明顯的神經(jīng)毒性作用。目前認(rèn)為放射增敏劑主要的作用機(jī)制為:促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、引起細(xì)胞周期阻滯于對(duì)射線敏感的G2或G1期、引起細(xì)胞自噬性死亡、影響信號(hào)傳導(dǎo)通路等。
　　CpGODN(CpG oligodeoxynucleotides)是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸片段,是細(xì)菌DNA產(chǎn)生免疫刺激作用的最小單位。近年來,CpGODN作為新的放射增敏劑

3、備受關(guān)注。實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為CpGODN的放射增敏作用與活化NK細(xì)胞、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌NO、TNF-α有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)是國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“放射增敏劑候選藥物CpGODN107的研究”(2009ZX09103-051)的研究內(nèi)容之一。以自主研發(fā)的CpGODN107為研究對(duì)象,探討CpGODN107對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的放射增敏作用并闡明其闡明其作用機(jī)制,為尋找高效、低毒的放射增敏藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),同時(shí)也為腦膠質(zhì)瘤治療提

4、供新的思路。
　　研究內(nèi)容及方法:
　　一、CpG ODN107增強(qiáng)U87細(xì)胞放射敏感性的體內(nèi)外生物學(xué)活性研究
　　1.體外放射增敏作用研究
　　(1)MTT法測(cè)定不同劑量的β射線(0、2、4、6、8、10Gy)對(duì)U87細(xì)胞活力的影響;不同濃度的CpGODN107(1、3、10、30、90μg/mL)對(duì)U87細(xì)胞活力的影響;CpGODN107聯(lián)合射線對(duì)U87細(xì)胞活力的影響。
　　(2)集落形成法評(píng)價(jià)CpGO

5、DN107聯(lián)合射線對(duì)U87細(xì)胞增值能力的影響。
　　2.體內(nèi)放射增敏作用研究
　　(1)建立人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠模型,評(píng)價(jià)CpGODN107聯(lián)合射線對(duì)移植瘤的生長抑制及腫瘤生長延遲時(shí)間的影響。
　　(2)建立人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞原位移植瘤裸鼠模型,評(píng)價(jià)CpGODN107聯(lián)合射線對(duì)裸鼠生存期的影響。
　　二、CpGODN107聯(lián)合射線對(duì)U87細(xì)胞增殖與死亡的影響。
　　1.流式細(xì)胞術(shù)觀察CpGO

6、DN107聯(lián)合射線對(duì)U87細(xì)胞周期的影響。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)觀察CpGODN107聯(lián)合射線對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.CpGODN107聯(lián)合射線對(duì)U87細(xì)胞自噬的影響。
　　(1)透射電鏡法觀察CpGODN107聯(lián)合射線對(duì)自噬體形成的影響。
　　(2)Westernblot檢測(cè)CpGODN107聯(lián)合射線對(duì)自噬標(biāo)志蛋白LC3和beclin-1表達(dá)的影響。
　　(3)免疫熒光觀察CpGODN107聯(lián)合射

7、線對(duì)U87/GFP-LC3細(xì)胞綠色熒光聚集的影響。
　　三、CpGODN107對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　1.CpGODN107對(duì)TLR9/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　(1)Griess法檢測(cè)U87細(xì)胞NO生成。
　　(2)ELISA法檢測(cè)U87細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)。
　　(3)Realtime-PCR檢測(cè)TLR9mRNA表達(dá)。
　　(4)ELISA法檢測(cè)U87細(xì)胞NF-κB活化。

8、　　2.CpGODN107對(duì)HIF-1α/VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　(1)免疫組化法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織CD34蛋白表達(dá),通過測(cè)量內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD34來計(jì)量微血管密度。
　　(2)ELISA法檢測(cè)U87細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)、腦膠質(zhì)瘤組織VEGF蛋白表達(dá)。
　　(3)Western blot法檢測(cè)U87細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)、免疫組化法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中HIF-1α蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　一

9、、CpGODN107對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞具有放射增敏作用研究。
　　1.10μg/mLCpGODN107能顯著提高U87細(xì)胞對(duì)β射線敏感性。
　　2.10μg/mLCpGODN107聯(lián)合射線(5Gy,7MeV)能顯著抑制U87細(xì)胞活力及增殖能力。
　　3.1.7、5、15mg/kgCpGODN107分別聯(lián)合單次大劑量射線(10Gy)對(duì)U87細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長具有明顯的抑制作用,其抑制率分別為27.3％、67.0%

10、和65.5%;同時(shí)能夠顯著延長其TGD和TVQT。
　　4.0.75,0.25and0.083mg/kgCpGODN107分別聯(lián)合大劑量射線(10Gy)能延長原位移植瘤模型裸鼠的中位生存時(shí)間(23d、28d、37.5d)。其中,0.083mg/kg的CpGODN107聯(lián)合單次大劑量射線(10Gy)能顯著延長原位移植瘤裸鼠的生存期。
　　二、CpGODN107對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞周期、凋亡、自噬的影響。
　　1.CpG

11、ODN107聯(lián)合射線可使U87細(xì)胞周期阻滯于G1期。
　　2.CpGODN107聯(lián)合射線不能促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡。
　　3.CpGODN107聯(lián)合射線可誘導(dǎo)U87細(xì)胞自噬。
　　(1)CpGODN107聯(lián)合射線可誘導(dǎo)U87細(xì)胞自噬體形成。
　　(2)CpGODN107聯(lián)合射線可上調(diào)自噬標(biāo)志蛋白LC3和beclin-1的表達(dá)。
　　(3)CpGODN107聯(lián)合射線可誘導(dǎo)U87/GFP-LC3細(xì)胞綠色熒光聚集。<

12、br>　　三、CpGODN107對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　1.CpGODN107對(duì)TLR9/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　(1)CpGODN107聯(lián)合射線可促使U87細(xì)胞NO生成。
　　(2)CpGODN107聯(lián)合射線可上調(diào)U87細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)。
　　(3)CpGODN107聯(lián)合射線可上調(diào)U87細(xì)胞TLR9mRNA表達(dá)。
　　(4)CpGODN107聯(lián)合射線可誘導(dǎo)U87細(xì)胞NF-κB活化

13、。
　　2.CpGODN107對(duì)HIF-1α/VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　(1)CpGODN107聯(lián)合射線可下調(diào)腦膠質(zhì)瘤組織CD34蛋白表達(dá),降低腦膠質(zhì)瘤組織微血管密度。
　　(2)CpGODN107聯(lián)合射線可下調(diào)U87細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)、下調(diào)腦膠質(zhì)瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)。
　　(3)CpGODN107聯(lián)合射線可下調(diào)U87細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)、下調(diào)腦膠質(zhì)瘤組織中HIF-1α蛋白表達(dá)。
　　研究

14、結(jié)論:
　　1.CpGODN107能增強(qiáng)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞對(duì)射線的敏感性。
　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,10μg/mLCpGODN107聯(lián)合射線能明顯降低腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞活力及細(xì)胞增殖能力;
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5mg/kgCpGODN107聯(lián)合射線對(duì)U87細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長具有明顯的抑制作用,其抑制率高達(dá)67.0%;0.083mg/kg的CpGODN107聯(lián)合單次大劑量射線能顯著延長原位移植瘤裸鼠的生存期。

15、>　　2.CpGODN107聯(lián)合射線可誘導(dǎo)U87細(xì)胞阻滯于對(duì)射線較敏感的G1期,不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但能誘導(dǎo)U87細(xì)胞自噬。提示,CpGODN107發(fā)揮放射增敏作用與其誘導(dǎo)U87細(xì)胞G1期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡密切相關(guān)。
　　3.CpGODN107可顯著增加人腦膠質(zhì)瘤對(duì)射線的敏感性。其作用機(jī)制可能為TLR9/NF-κB途徑介導(dǎo)U87細(xì)胞釋放放射增敏分子NO;也可能是阻斷HIF-1α/VEGF信號(hào)通路抑制腫瘤組織周圍新生血管的形成。