外源性IGFBP-2對神經膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響研究.pdf

1、前言：
　　膠質瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，其中膠質母細胞瘤是成人膠質瘤中惡性程度最高的一種，患者平均生存時間為15個月[1]。除手術之外，術后的放療加化療是有效的治療方法，能明顯延長一些患者的生存時間[2]。然而，各種類型的調節(jié)因子，如生長因子、激素類因子等導致治療的失敗[3-4]。
　　胰島素樣生長因子結合蛋白-2(Insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP-2)是

2、由各種組織通過復雜的調節(jié)過程產生的[5]，先前研究已經證實膠質母細胞瘤中IGFBP-2的表達水平明顯高于低級別的神經膠質瘤和正常腦組織，并通過IGF依賴性或非依賴性作用機制發(fā)揮其生物學特性[6-8]。膠質母細胞瘤患者血清中IGFBP-2的水平明顯增高，并與患者的生存率呈負相關[9-10]。然而，血清中IGFBP-2對本病的進展及預后影響的分子機制并不清楚。盡管IGFBP-2內源性過表達與細胞的增殖和侵襲有關，但這些結果一直是有爭議的[1

3、1-15]。并不能解釋血清中IGFBP-2的潛在作用，外源性IGFBP-2的作用需要進一步被闡明。
　　IGFBP-2含有Arg-Gly-Asp(RGD)細胞粘附區(qū)域，并能潛在綁定在整合蛋白受體上，并進一步激活細胞外信號調節(jié)激酶(ERKs)?，F(xiàn)已經證實當惡性腫瘤細胞受到外部刺激時整合蛋白-ERK通路激活并誘導細胞增殖和侵襲[16-18]。本研究旨在探討外源性IGFBP-2對不同級別膠質瘤增殖和侵襲的影響，及相關的分子機制。同時探討

4、外源性IGFBP-2對膠質瘤化療藥物替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)耐藥性的影響。
　　材料和方法：
　　1、細胞培養(yǎng):
　　人膠質母細胞瘤細胞系U87，U251和U373細胞購自中國科學院上海細胞庫。人惡性膠質母細胞瘤細胞系T98G從美國標準培養(yǎng)收集所獲得(ATCC，Rockville，MD，USA)。SU3膠質瘤細胞由蘇州大學第二附屬醫(yī)院提供。細胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清(fetal bovine ser

5、um，F(xiàn)BS;Invitrogen)的DMEM(Dulbecco's modifiedEagle's medium;Gibco)培養(yǎng)基。在37℃，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
　　2、IGFBP-2過表達結構構建
　　人IGFBP-2 cDNA克隆于pEGFP-N1質粒(Clontech，Mountain View，CA，USA)，合成pEGFP-N1-IGFBP-2質粒和對照pEGFP-N1質粒應用陽離子脂質體(Lipofect

6、amine，Invitrogen)轉染至U87細胞，通過G418篩選出穩(wěn)定轉染細胞系，通過western-blot檢測IGFBP-2過表達的有效性。
　　3、RT-PCR
　　按TrizolTM試劑使用說明提取細胞總RNA，檢測其濃度，純度和完整性。按逆轉錄試劑盒使用說明操作，選用Oligo-dT做引物合成第一鏈cDNA，引物序列IGFBP-2 forward,5'-AGGTTGCAGACAATGGCGAT-3', IGFB

7、P-2 reverse,5'-GTAGAAGAGATGACACTCGG-3'; GAPDH forward,5'-GCACCGTCAA-GGCTGAGAAC-3',GAPDH reverse,5'-TGGTG AAGACGCCAGTGGA-3'。反應條件為:94℃2分鐘;30×(94℃30秒，61℃30秒，72℃90秒);72℃10分鐘。
　　4、Western Blot法檢測蛋白
　　收集細胞加入裂解液充分裂解，低溫高速離

8、心（4℃，12000轉/min，30min），提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳（12％SDS-PAGE凝膠）、轉印(70V，120min)、5％正常小牛血清封閉，一抗4℃孵育過夜，分別與對應的二抗室溫孵育2h，ECL顯色，結果經自動電泳凝膠成像分析儀（Chemi Imager5500，AlphaInnotech，USA）采集，進行灰度值測定。
　　5、免疫熒光染色
　　接種細胞于24孔板中，多聚甲醛固定，用0.2

9、％的Triton-X100于常溫打孔15-30分鐘。1％的BSA常溫封閉30分鐘。封閉完后加入一抗，4℃過夜。次日，加入相應二抗，室溫孵育1個小時后，Hoechst33342染核，熒光顯微鏡觀察。
　　6、MTT法檢測細胞增殖
　　將單個細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul含103個細胞，培養(yǎng)24h，每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4hr，吸去上清液，加入150ulDMSO(Sigma，USA)，振蕩10min，490

10、nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作為對照。繪制細胞生長曲線。
　　7、細胞計數(shù)
　　細胞種植在24孔板，每孔種植5×103個細胞，在DMEM+10％FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，血清饑餓過夜，不同處理因素處理48h，PBS沖洗，胰酶消化成單細胞懸液，臺盼藍染色后進行細胞計數(shù)。
　　8、流式細胞儀檢測細胞周期
　　收集對數(shù)生長期細胞制成1×106個/ml細胞懸液。75％冷乙醇于4℃固定過夜、離心后制

11、成500μL的細胞懸液，加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分鐘后上機檢測，ModFitLT3.0軟件分析細胞周期。
　　9、Transwell基質膠細胞侵襲試驗
　　用無血清的培養(yǎng)基將Matrigel加入到孔徑為8.0μm的Tranwell小室中，向小室的上室中加入100μl的細胞懸液(5×105cells/ml)，下室中加入含10％FBS的血清作為趨化誘導劑，孵箱中孵育36小時后取出，用無菌的棉簽擦拭去上室的膠，濾膜經固定、

12、染色后封片，鏡檢10個高倍視野(400×)。
　　結果：
　　1、內源性IGFBP-2影響神經膠質瘤細胞的侵襲
　　分別應用RT-PCR和western-blot檢測了4種膠質母細胞瘤細胞和原發(fā)SU3膠質瘤細胞中IGFBP-2的表達水平。根據(jù)表達水平在U87細胞中轉染p-EGFP-N1-IGFBP-2質粒，并進行western-blot檢測，其IGFBP-2的表達水平明顯上調。MTT檢測發(fā)現(xiàn)U87細胞中過表達IGFBP

13、-2，細胞的增殖能力并沒有改變，侵襲實驗發(fā)現(xiàn)高表達IGFBP-2的U87細胞其侵襲能力明顯增強(P＜0.01)。
　　2、外源性IGFBP-2促進膠質母細胞瘤細胞的增殖和侵襲
　　通過相差顯微鏡觀察到IGFBP-2處理后的細胞其生長速度明顯加快。MTT分析得出外源性IGFBP-2誘導細胞增殖，并呈劑量依賴性。125ng/ml和250ng/ml的IGFBP-2處理細胞后，細胞的增殖率增加了33.8％-62.7％，500ng/m

14、l的IGFBP-2處理細胞，其增殖率增加了約1.4倍。在IGFBP-2處理細胞24h后應用PI染色檢測了細胞周期，結果顯示IGFBP-2能促進U87、U251、SU3細胞進入S期和G2/M期，并呈劑量依賴性。125和250ng/ml的IGFBP-2能使G2/M期細胞比例由0-2.7％增加到8.1-17.4％，500ng/ml的IGFBP-2使G2/M期細胞比例達到30％。
　　應用基質膠侵襲分析檢測外源性IGFBP-2對U87、U

15、251和SU3細胞遷移的影響，IGFBP-2使膠質瘤細胞的侵襲能力明顯增強，并呈劑量依賴性。125和250ng/ml的IGFBP-2使細胞的侵襲能力增加了37.8-87.4％，500ng/ml的IGFBP-2使細胞的侵襲能力增加了近1倍。
　　3、外源性IGFBP-2通過ERK信-號通路促進膠質母細胞瘤細胞的增殖和侵襲
　　膠質瘤細胞在500ng/mlIGFBP-2處理培養(yǎng)后，不同時間點提取蛋白應用western-blot檢

16、測ERK的活性。盡管總ERK蛋白的表達水平沒有增加，但是IGFBP-2處理30min后，與對照組相比，磷酸化的ERK(p-ERK)蛋白表達水平明顯增高。免疫熒光檢測500ng/ml外源性IGFBP-2處理細胞30min后增強了ERK的磷酸化和核的轉入。在U87、SU3、U251細胞中加入ERK的阻斷劑PD9805后再加入外源性IGFBP-2培養(yǎng)細胞，檢測發(fā)現(xiàn)加入ERK阻斷劑后抑制了IGFBP-2誘導的細胞增殖和侵襲。
　　4、IG

17、FBP-2誘導對TMZ的耐藥性
　　應用100μM的TMZ處理U87細胞后，細胞的增殖明顯受到抑制(抑制率64.2％)，而在TMZ之前應用500ng/ml的IGFBP-2處理細胞，TMZ對細胞增殖的抑制被IGFBP-2消除，應用ERK的抑制劑PD98059或抗整聯(lián)蛋白β1中和抗體能對抗IGFBP-2的影響。應用基質膠侵襲實驗檢測了TMZ對U87細胞侵襲的影響，TMZ處理細胞后明顯抑制了細胞的侵襲能力（抑制率44.7％）。而在TMZ